《cho细胞表达系统的应用与研究.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《cho细胞表达系统的应用与研究.ppt（23页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、CHO细胞表达系统的应用与研究进展,刘畅国药集团长春生物制品研究所生物技术研究室2009/11,长生研,主 要 内 容,CHO细胞表达系统的优势与国内外应用情况,CHO细胞的工程化,构建CHO细胞表达平台的意义和流程,简介基因重组生物技术产品的表达系统及应用,长生研,基因重组生物技术产品的表达系统,大肠杆菌表达系统,酵母表达系统,哺乳动物细胞表达系统,分子量较小、结构相对简单的蛋白质,分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质,结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质,长生研,大肠杆菌表达系统的应用,大肠杆菌表达的生物技术药物有 20 种，分别是甲状旁腺激素、利尿钠肽、胰岛素及其两种突变体、生
2、长激素、干扰素、和，G-CSF、白介素-1Ra、白介素-2、白介素-11、rPA、白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白等。这些产品都是结构相对简单、分子量较小的蛋白质，主要为细胞因子类药物。这 20 种产品中，有 16 种为2000年以前批准上市的，说明了E coli.表达系统的应用空间已经越来越小。,长生研,酵母表达系统的应用,酵母表达的生物技术药物有 8 种，分别是尿酸水解酶、胰高血糖素、GM-CSF、血小板衍生生长因子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗(小S)、胰岛素Novolin及其突变体NovoLog、水蛭素等。酵母表达的蛋白相对 E coli.表达系统分子量较大、结构较复杂。不
3、过，虽然酵母表达系统表达的蛋白有糖基化修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，对于糖链极大影响生物活性的蛋白质如 EPO、治疗性抗体等，仍无法用酵母表达系统表达。,长生研,哺乳动物细胞表达系统的应用,长生研,CHO细胞表达系统的优势与国内外应用情况,国内CHO细胞表达的不足之处,国内CHO细胞表达系统的应用情况,FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物,CHO细胞的五大应用优势,提高CHO细胞产量的策略,长生研,生产用哺乳动物细胞株,CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）：上皮样细胞。当前被用来表达tPA、EPO、单抗、V因子等重组蛋白。BHK细胞（仓鼠胚肾细胞）：成纤维样细胞。过去用于增殖病毒
4、，并制作疫苗。现在也用于工程细胞构建。表达产物主要是V因子。NSO细胞（小鼠胸腺瘤细胞）：转化的淋巴细胞。主要表达用于单抗。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。,长生研,CHO细胞的五大应用优势,长生研,FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物,长生研,国内CHO细胞表达系统的应用情况,上市产品：促红细胞生成素（EPO）哈药集团、华北制药、沈阳三生、成都地奥、山东阿华、北京四环、上海科华、上海凯茂、山东科兴、深圳赛保尔、深圳新鹏、开封大鹰、山西威奇达共 13 家制药厂生产。基因工程乙型肝炎疫苗 长春所、兰州所、武汉所、成都所、华北制
5、药、北京华尔盾 6 家。重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（益赛普）上海中信国健药业。目前拥有 2条300L抗体药物细胞培养中试工艺验证生产线，4条750L抗体药物细胞培养生产线和新增2个2500L的细胞反应罐。生产能力为年产2ml西林瓶装12.5mg冻干粉针剂400万支（50kg），生产能力仍滞后于市场需求。处于临床研究阶段：重组抗EGFR人源化单抗（泰欣生）百泰生物重组Her2人源化单抗 中信国健重组抗CD25人源化单抗 中信国健重组人MNV-骨形态发生蛋白-2 重组人尿激酶原临床前：重组人促卵泡激素长春金赛,长生研,国内CHO细胞表达系统的两大技术瓶颈,表达量低,生产方式落后中国
6、：贴壁、转瓶培养 美国：悬浮或微载体、罐培养,以tPA为例，达到年产量100克,长生研,提高CHO细胞产量的策略,目的基因各种调控元件-基因拷贝数、转录、翻译、折叠、分泌,生物反应器的选择培养方式的选择：流加、灌流、批式还是反复批式培养。至少70%的产品采用搅拌式悬浮培养。,表达量低、产量不稳定,表达量提高、更适合大规模培养,长生研,构建自分泌生长型CHO细胞,改善细胞的糖基化功能,改变细胞的能量代谢途径,工程化CHO细胞改造策略,控制细胞增殖速率,增强细胞抗凋亡活性,长生研,增强细胞抗凋亡活性,细胞凋亡是大规模培养中细胞死亡的主要原因，是实现高密度培养的最大障碍。因此防止细胞死亡可以提高细胞
7、密度，延长培养周期，从而提高产量。,过表达 bcl-2 或者 沉默 caspase-3,凋亡信号的传递过程,培养周期延长细胞活性提高2-4倍细胞碎片减少10倍以上细胞密度提高2-3倍产量增加3倍左右,长生研,控制细胞增殖速率,特点：将细胞周期调节基因至于可诱导性启动子之后。,细胞周期调控示意图,细胞生长静止，可持续几周产量增加10-30倍,长生研,改变细胞的能量代谢途径,葡萄糖消耗速率下降1-4倍乳酸生成降低1-2.5倍谷氨酰胺消耗降低2倍左右氧消耗增加3倍左右批式培养周期延长2-3天细胞密度提高1-2.5倍产量增加3倍左右,长生研,改善细胞的糖基化功能,表征糖蛋白的诸多参数：糖基化氨基酸百分
8、率、N-连接寡糖和多糖的糖链形式、末端糖残基数、N-羟乙酰神经氨酸的切割位点、糖链与糖链之间的连接方式、寡糖链末端唾液酸化百分率等。糖链影响糖蛋白的药理活性、生理生化特性（溶解性、稳定性、折叠和分泌）及药代动力学（半衰期、靶向性、免疫原性和抗原性）不同的细胞由于糖基转移酶的种类和活性有很大不同，其表达的糖蛋白糖链的结构各不相同。主要策略：引入编码糖基转移酶或糖苷酶的基因，或者封闭不希望的糖基化形式。效果：经过糖基化改进的CHO细胞表达的蛋白，其在体内的生物活性是原蛋白的10-20倍。,长生研,构建自分泌生长型CHO细胞,目的：实现无血清培养。FDA自2002年起已不再批准用含血清培养液生产的生
9、物制品。现在50%以上的细胞产品采用无血清培养方式。血清的缺点：含有具细胞毒作用的多胺氧化酶成分。不能保证批与批之间的稳定性。杂蛋白含量多，增加下游分离纯化的难度和成本，使产品的质量下降。成本高，使用10%浓度就占培养液成本的90%。适于CHO细胞生长的商业化无血清培养液有CHO-S-SFM II(LTI)、CCM5(HyClone)和proCHO-CDM(BioWhittaker)，但价格较高。现有的无血清培养通常是在细胞生长期添加血清，而在细胞生产期逐渐降低血清浓度，用各种生长因子来替代，并非真正的无血清培养。目前导入的热点基因主要是各种细胞因子，如IGF-1、EGF和转铁蛋白基因。,长生研,重组蛋白CHO表达平台的构建流程,获得抗凋亡、增殖可控、代谢途径优化和不依赖血清培养的工程化CHO细胞,克隆目的基因和与之相应的整合、转录、翻译、筛选等相关元件，装配表达质粒,获得表达量不低于 50g/106cellsd 的稳定细胞株,实验室-中试-生产规模 建立培养工艺,长生研,2007年 TOP 10生物技术药品销售情况,注：红色字体的为CHO细胞表达产品,长生研,FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物,Thank You!,
