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1、第七章 RNAi,法尔目前任职于美国麻省理工学院，梅洛目前在美国哈佛大学工作。他们将分享1000万瑞典克朗（约合140万美元）的奖金。,2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁法尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了“RNA（核糖核酸）干扰”机制。,诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。,RNA interference,梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入
2、科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。,法尔(Andrew Fire)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。,哺乳动物细胞中的 RNAi 现象,长链dsRNA,所有基因表达下降,RNAi 现象,PKR,RNase L 活性化,X,干扰素,提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）,一、RNA干扰的发现,94年Cogoni等证明真菌中亦有
3、类似现象，此称为基因压制(quelling)。,90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),一、RNA干扰的发现,一、RNA干扰的发现,1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegan
4、s中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。,A control:not stainedB:wtC:wt+antisense RNAD:wt+ds RNA,Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization,Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe.(B)Embryo from uninjected parent showing normal pattern of end
5、ogenous mex-3 RNA(purple staining).(C)Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA.These embryos(and the parent animals)retain mex-3 mRNA,although levels may be somewhat less than wild type.(D)Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3;no mex-3
6、 RNA is detected.(Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.),Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos.,一、RNA干扰的发现,2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，200
7、1，411（6836）：494498RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。,二、RNA干扰的机制,dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链Dicer：属于RNase 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA：small interfering RNA，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNARISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依赖RNA的RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递,预备知
8、识：,基因沉默,二、RNA干扰的机制,转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS),TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默。对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致；PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。,基因沉默,RNAi的作用原理,双链RNA（dsRNA）(外源的或体内产生的)首先被降解为具5单磷酸、长2123bp 的小分子双链RN
9、A,这种RNA小分子称为小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）。siRNA具相似的结构特征:为长约2123bp 的双链RNA,具5单磷酸和3羟基末端,互补双链的3端均有一个23nt 的单链突出。,二、RNA干扰的机制,1.siRNA的产生,一种称为Dicer 的核酸酶负责将dsRNA 转化为siRNA。它属于RNase 家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA 上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个
10、位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp 的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer 结构略有不同,致使siRNA 长度存在微小差别。,二、RNA干扰的机制,Dicers,2.siRNA介导mRNA降解,siRNA 形成之后,与一系列特异性蛋白结合形成siRNA 诱导干扰复合体(siRNA induced interference complex,RISC),在ATP存在下，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解,从而导致特定基因沉默。,RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。,二、RNA干扰的机制,3.RNAi 的 特异性和高
11、效性,许多研究显示RNAi 过程中有新的dsRNA 分子的合成。当siRNA 反义链识别并结合靶mRNA 后,siRNA 反义链可作为引物,以靶mRNA 为模板在依赖于RNA 的RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)催化下合成新的dsRNA,然后由Dicer 切割产生新的siRNA,新siRNA 再去识别新一组mRNA,又产生新的siRNA,经过若干次合成2切割循环,沉默信号就会不断放大。,二、RNA干扰的机制,Cap,AAAAAA,Cap,AAAAAA,Cap,AAAAAA,循环,复制酶,Dicer,切割,RNAi机制,DicerRISC碱基互补
12、酶解,RNAi的放大效应机制,二、RNA干扰的机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。,Gisela Storz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性；只有
13、dsRNA才能诱导产生RNAi；只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；,二、RNA干扰的机制,RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：,二、RNA干扰的机制,RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。dsRNA不得短于21个碱基，大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特
14、异性和全面的基因表达受抑和凋亡；RNAi作用迅速，mRNA快速降解；RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。,RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：,short-interfering RNA,加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段,Tuschl,2001,Dicer contains two RNAse III domains,siRNAs,long dsRNA,RISC:RNA-Induced Silencing Complex,Exonuclease,Homology search activity,Endonuclease,
15、Helicase,5,3,形成RISC复合物，降解目的mRNA,利用生物学软件组配长链 oligo，（合成单链DNA（直接带有4个bp的酶切位点粘性末端)；载体构建：dsDNA形成：annealing 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾,RNAi主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明
16、，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。,三、RNA干扰的应用,三、RNA干扰的应用,1.基因功能研究,由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA使目的基因沉默，研究基因的功能。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。,如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。,Chiou-Fen Chuang and Elliot M.Meyerowit
17、z*PNAS April 25,2000 vol.97 No.9 49854990,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周淋巴细胞，不影响另一种HIV-1的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,艾滋病,RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因表达 利用RNA
18、i 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖 利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,最早用于HIV研究，被Science评为2002年年度突破。斯坦福医学院的研究群，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断
19、的明显效果。,HBV,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。,HCV,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,其它病毒,Hu WY等证明了siRNA能阻抑逆转录Rous 肉瘤病毒（RSV）感染脊椎动物；Leon
20、id等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制，加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒；Jia等发现Rta-siRNA(Rta是疱疹病毒基因表达的一种起始转录因子)和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。,三、RNA干扰的应用,3.肿瘤治疗,用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。,(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。,Li等在3个肝癌细胞系Hep3B
21、、HepG2、SNU449中对cyclin E的研究中发现，转染siRNA组48 h后生长抑制均达到90，而对照组无作用，3天后凋亡率分别为16、44和3l，而对照组仅为l。,三、RNA干扰的应用,3.肿瘤治疗,应用RNAi技术抑制肿瘤细胞（如肝癌细胞、胆管癌细胞等）中血管生长因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，以及抑制肿瘤细胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。,Figure.Use of Chemically Synthesized and in Vitr
22、o Transcribed siRNAs targeting-Actin to Induce Gene Silencing.,Ku-70 levels were reduced 86%in cells transfected with the siRNA cocktail,compared to non-transfected controls.,三、RNA干扰的应用,4.抗器官移植排斥反应,细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生
23、的程度和缺血再灌注损伤。,4.RNAi在整形外科领域的应用前景已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4，将在治疗中起关键作用。2004年，美国FDA批准经过修饰的第一个RNAi药物Bevasiranib 进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变。,三、RNA干扰的应用,dsRNA,Dicer,
24、形成复合物,靶RNA,6在功能基因组中的应用,由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为RNAi技术。根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。,三、RNA干扰的应用,6 RNA干扰和转座子沉默研究,目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一，发现
25、蠕虫mut-7基因参与RNAi和转位抑制。其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA，并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列含转座子片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR（长末端重复序列）介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。,三、RNA干扰的应用,7基因组重组,siRNA可能参与纤毛虫，四膜虫虫体间结合时的基因重组。结合到重组序列的siRNA，在虫体之间的结合过程中介导DNA缺失和染色体断裂。有趣的是，在这些siRNA介导的程序性DNA删除事件中，也发现需要重组区域组蛋白的甲基化
26、。,三、RNA干扰的应用,三、RNA干扰的应用,4.药物开发,利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。,利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题：（1）导入问题，使用高效载体传递siRNA；（2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性；（3）高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其
27、他细胞。,三、RNA干扰的应用,RNAi 为抗肿瘤、抗病毒及遗传病等的基因治疗带来了新的希望,也为基 因功能研究提供了强有力的工具。但目前也存在一些问题:RNAi 的作用机制尚不很清楚,使RNAi 的广泛深入应用受一定影响。针对哺乳动物细胞的siRNA 设计和筛选有很大的盲目性,需经过反复试验才能筛选出有效作用位点,在理论和技术上有待突破。有些mRNA 的靶序列与蛋白质紧密结合成复合物,被蛋白质封闭了其作用位点。与其他基因治疗一样,制约RNAi 技术治疗疾病有2 个严重的问题,其一是效率低下的载体系统,其二是人们对基因功能认识的广度和深度远不能满足应用的需要,还须在理论与技术的源头上作长久不懈
28、的努力。由于RNAi 独特的作用机制,使其抑制靶基因表达的效率远高于反义核酸技术,又由于RNAi 技术流程简便,周期短,因此RNAi 有可能代替反义核酸技术及基因敲除技术而成为基因功能研究的主力军，在基因治疗方面也显示出诱人的前景。,三、RNA干扰的应用,四、RNA干扰的研究方法,一般技术路线,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的设计,1.从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。2.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠
29、等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST3.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的设计,4.一个完整的siRNA实验应该有阴性对照。作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,5.计算机软件辅助设计，如Rational_siRNA_design.xls等。,6.Internet资源的应用：目前已证实的siRNA序列htt
30、p:/,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,1.化学合成siRNA是最贵的方法，但是却是最方便的许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,2.体外转录合成siRNA相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的
31、筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,四、RNA干扰的研究方法,3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA
32、。这种方法制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNase III(or Dicer)在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,siRNA的制备,四、RNA干扰的研究方法,dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这
33、种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，虽然现在多数的研究显示这种情况通常没有发生。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。,siRNA的制备,四、RNA干扰的研究方法,4.利用质粒或病毒载体表达siRNA多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的
34、小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。,siRNA的制备,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,siRNA表达载体的构建,四、RNA干扰的研究方法,由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即
35、使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。,siRNA的制备,四、RNA干扰的研究方法,开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。适用于长期研究。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。,siRNA的制备,除质粒载体外，科研人员已经成功地采用逆转录病毒
36、载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的DNA模板序列转移入哺乳动物细胞。现在许多学者正在加紧腺病毒载体的siRNA转移研究。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5.PCR方法制备siRNA的表达框架siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时
37、的步骤，可以直接由PCR得到。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。,四、RNA干扰的研究方法,如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长期研究。主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了
38、）。,siRNA的制备,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5种siRNA制备方法的比较,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5种siRNA制备方法的比较,反义核酸设计与修饰技术 选择靶序列，提高制剂的稳定性，细胞捕获率（一）反义核酸靶位序列设计 空间结构影响互补核酸接近 1、反义寡核苷酸文库（随机法）利用基因文库目的基因序列，合成一系列寡核苷酸（50-100个），针对mRNA不同区域，检验诱导反义作用的能力。费时费力,四、RNA干扰的研究方法,2、计算机模拟预测易感靶位 易感性受空间结构尤其是折叠的影响 计算机模拟RNA(目的基因)二级结构开放环，膨出部分易于杂交 仅有个别m
39、RNA二级结构数据。,四、RNA干扰的研究方法,3、避免序列相关的非反义活性及毒性,非甲基化CpG二聚核苷酸序列引发特异性的免疫激活 免疫效应细胞有识别CpG的受体，激活B细胞，抗体分泌,诱导产生许多细胞因子 脊椎动物DNACpG被抑制，处于高度甲基化状态，含量很低CpGGpC 刺激作用降低，设计时避免CpG,四、RNA干扰的研究方法,(二)寡核苷酸的化学修饰 经血液循环细胞内蓄积在胞内小体，高尔基体等细胞器中,到达靶位基因很少。DNA,RNA在细胞体系中很快被血清酶降解磷酸骨架硫代修饰 第一代:将磷酸二酯骨架的非桥氧原子换成S，提高抗性，透过性差 第二代:混合骨架寡核苷酸 第三代:肽核酸,四
40、、RNA干扰的研究方法,肽核酸（PNA）技术 PNA是一类用肽链骨架代替核酸中的磷酸戊糖骨架而形成的新型分子。它保留了与互补DNA或RNA配对结合的特性，且其特异性和亲和力都比相应的寡核苷酸高，同时又能抵抗所有核酸酶和蛋白酶的降解。PNA插入双链DNA形成稳定的杂交体后，可抑制其转录和复制；与RNA结合可抑制翻译。,四、RNA干扰的研究方法,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的导入,1.细胞的导入,siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但是其转染效率只有10%，那么总的抑
41、制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。但是有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的RNAi研究。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的导入,siRNA导入细胞的常用方法：1）磷酸钙转染2）DEAE-葡聚糖介导的转染3）电穿孔4）脂质体载体介导（目前有的较多）5）显微注射技术6）DNA载体转染（病毒等）,各种方法适用于不同的细胞，但总的说来，效果都不甚理想。这是由于生物体具有本能地抵御外来物的趋势。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的导入,2.在体的导入,1）直接注射真核表达载体如赵金红等将SRY干扰载体(pSilencer 4.1/Sry
42、217 及pSilencer 4.1/Sry565)注射到孕期11.5天的小鼠尾静脉，干扰胚胎小鼠SRY表达。通过RT-PCR检测，发现干扰的小鼠SRY表达受到明显抑制。2）病毒感染腺病毒载体；逆转录病毒载体；慢病毒载体3）移植适合血细胞中表达的基因,A：生理盐水B：空载体C：pSilencer 4.1/Sry565D：pSilencer 4.1/Sry217,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的效果分析,可从mRNA和蛋白质两方面进行1）mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。2）蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参
43、数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的效果分析,Western blot 检测HEK 293 细胞荧光素酶表达水平,荧光素酶表达,-actin表达,Lane 1:circular vector alone.Lane 2:vector containing siRNA insert.Lane 3:vector containing negative control siRNA insert.,五、RNA干扰存在的问题,目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。,目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移入体内成为
44、RNAi应用的最大障碍；,如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不清楚；,如何将RNAi技术运用到临床试验,siRNA的稳定性,在多基因家族中的非特异性问题,制备siRNA5种不同方法的比较,（三）RNAi 的生物学功能,通过组蛋白甲基化影响染色质结构:Volpe等（2002）的研究表明，至少在裂殖酵母中,RNAi 机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。通过DNA 甲基化在转录水平调节基因表达对RNAi 相关基因。在翻译水平调节机体发育。作为基因组的免疫系统。研究表明RNAi 机制在真核细胞中起着类似动物
45、免疫系统的作用,充当基因组的防护者。,The Human Immunodeficiency Virus(HIV)Life Cycle and RNA Interference.N Engl J Med,Vol.347,No.17 October 24,2002,商品化载体的siRNA策略示意图,五、siRNA Expression Cassettes(SECs)方法,快速、不需要克隆测序等步骤适用于筛选多个候选靶点序列的抑制效率,2、http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/3、http:/or http:/,1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）,目的基因mRNA获取：,寻找siRNA序列,https:/支持accession number 或者序列直接输入 参数设计全面 输出经过筛选的candidate target（BLAST）推荐http:/最全面的RNA实验相关网站 有商品化的各类载体 获得siRNA target 需要手工BLAST 输出直接可递交公司合成的长链oligo 推荐,
