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1、免疫分析中的干扰与消除,靳增明2010-6-12,内容概要,1.概述2.主要内容3.结语,1.溶血等常见内源性干扰2.类风湿因子3.补体4.异嗜性抗体5.HAMA6.自身抗体7.结合蛋白8.其他干扰因素,概述,基础、前沿的话题普遍、常见的现象复杂、多样的本质深刻、直接的影响长远、艰巨的任务,定义,IFCC：样本中被分析物质外存在的因素，产生的检测信号，表现在检测结果上的系统性错误。分析物不相关的因素 溶血、脂血、抗凝样本、样本保存等分析物相关的因素 类风湿因子，异嗜性抗体，自身抗体等,免疫分析中干扰的分析,不同次检验结果的对比的不一致性检验结果与临床症状不符系列检验结果的矛盾极度偏离，难以置信
2、的检验结果稀释回收高度偏离预期与其他检验试剂或方法相背离的结果,常见“干扰”因素,溶血高胆红素脂血（对脂溶性物质的干扰，NEFA）抗凝样本（添加剂，分离胶）样本的稳定性与保存条件,内源性激素结合蛋白,白蛋白TBG，SHBG，CBGFDH（家族性异常白蛋白高甲状腺素血症）游离激素的测定（标记抗原，标记抗原类似物，标记抗体）,内源性抗体等干扰因素,类风湿因子、补体、溶菌酶、异嗜性抗体，HAAA等10%以上（30-40%）的病人体内存在内源性异嗜性抗体（CAP）10%-40%的人群存在HAMA干扰，取决于检测试剂（Larry Kricka,President,AACC）我国临床医疗总误诊率为27.8
3、%，比国际平均临床医疗总误诊率25%高2.8个百分点，其中恶性肿瘤误诊率为40%（2008），抗体干扰是其中原因之一。,异嗜性抗体产生的途径,类风湿性关节炎流行性感冒过敏输血自身免疫疾病免疫抑制药物心肌病变注射疫苗,动物接触（饲养宠物）特定食物（奶酪）动物辅助治疗（胸腺细胞，胚胎细胞，羊细胞）血液透析母婴传递肠胃炎（E.coli）,类风湿因子（Rheumatoid factors，RF）,自身抗体，体内产生的以变性IgG（一种抗体）为抗原的一种抗体，通常为IgM，结合IgG的FC片段。约90%类风湿性关节炎（RA）患者的RF呈阳性，在其他自身免疫疾病中也有一定的阳性率。正常人有5%左右的阳性率
4、,类风湿因子（Rheumatoid factors，RF）,去除 Fc片段，用F（ab）2替代完整的IgG热变性IgG处理检验抗原时，加入2-巯基乙醇使RF降解。,类风湿因子（Rheumatoid factors，RF）,IgM测定方法：捕获包被和中和IgG,补体（Complement）,存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。约占血清球蛋白总量的10。极不稳定，大部分对热敏感，5630分钟即失去活性。结合IgG的Fc片段，封闭结合位点。新鲜血清中的补体对试剂反应干扰较大除热灭活外，可用EDTA稀释标本缓解补体的影响。亦有推荐在试剂中加入鸡IgG的，以抑制补体激活,溶
5、菌酶（Lysozyme）,一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中 强烈结合低等电点蛋白，可桥接固相和标记抗体导致假阳性。可加入铜离子，形成络合物可在试剂中加入卵清蛋白（pI=4.9）鸟蛋白（beckman）,异嗜性抗体（Heterophilic antibodies，HA）,HA是存在于人类血清中，由已知或未知的抗原物质刺激人体产生的，与啮齿类动物（如鼠等）Ig（s）结合的一类抗体。通常是由于直接接触动物，污染的食品，接种动物血清或疫苗而产生。可分为天然抗体和自身免疫抗体，亲和力低，结合力弱，具有广泛的
6、特异性，普遍存在于人体中，多为IgG。HA可与试剂中抗体的Fc或者F(ab)区域的决定簇结合，从而干扰免疫反应。,人抗动物抗体（HAAA）,与HA具有一定的同源性，均能发生交叉反应，造成干扰免疫途径较为明确，动物免疫球蛋白治疗或接触史具有高亲和力，可定向结合到动物的抗原表位上HAAA有IgA，IgG，IgM等多种类型，又可分为抗同种型，抗独特型，抗抗独特型等三类物种广泛，目前已报道抗鼠，牛，山羊，绵羊，马等多种抗体不同种动物Ig分子间蛋白质序列有大量同源性，因此抗动物抗体可与多种动物免疫球蛋白发生交叉反应接触动物蛋白两周后可产生抗体，存在时间可长达30个月,人抗鼠抗体（HAMA）,由于鼠抗在单
7、克隆抗体影像，抗体治疗以及诊断试剂中的广泛应用，使得HAMA尤其受关注抗同种型，抗独特型，抗抗独特型,HAMA干扰机制,HAMA干扰机制,HAMA的鉴别,稀释样本测定的值不成比例用参考试剂盒测定进行对比其他试剂盒验证加入清洁抗体进行对比HAMA测定试剂盒（6 HAMA试剂盒）包被鼠抗，标记鼠抗的夹心法 包被鼠抗，标记抗人IgG/IgM的间接法,内源性抗体干扰的消除,试剂盒的设计 原材料的选择 去除Fc片段 嵌合抗体（Roche TSH/CEA）鸡抗体样本的预先处理 固相血清吸附 蛋白A之类的固相吸附剂 PEG6000处理样本 样本酸和热联合处理加入阻断剂 清洁抗体,商品化的异嗜性抗体阻断剂,H
8、BR：单克隆鼠抗人IgMIIR：由异嗜性抗体和人抗动物抗体为免疫原产生的混合的鼠单抗。,简单了解ROCHE（IEP）,简单了解ROCHE（IEP）,简单了解ROCHE（IEP）,自身抗体（Autoanalyte antibodies),嗜靶抗原的自身抗体，与靶抗原结合形成复合物，可对靶抗原的测定结果造成干扰。目前已知存在的自身抗体：THAAB、Anti-Tg、IAA，Anti-PRL等干扰举例：高泌乳素血症（巨泌乳素）有生物和免疫活性的 23kD 泌乳素单体；缺乏生物活性约50-60kD 的大泌乳素；无或不发挥任何生物活性但有免疫反应性 150-170kD 的巨泌乳素。巨泌乳素：PRL 与其
9、IgG型抗体结合形成的免疫复合物,因其分子量大而不能通过毛细血管壁,无法与受体结合而不能发挥生物活性,在体内的半衰期较长,在循环中累积,被视作PRL 检测从而造成 PRL 浓度的假性增高。样本用PEG沉淀处理,其他一些干扰因素,副蛋白（paraprotein）由异常增殖的肿瘤浆细胞产生的免疫球蛋白。粘度增加导致样本量减小/非特异性的结合分析物或抗体纤维蛋白原 干扰反应过程药物，类似物，代谢物HOOK效应,总结,监管机构/制造商/临床实验室甚至病人作为制造商我们可以做的 试剂盒的研制 预见试剂盒的用途，在说明书上注明试剂盒的局限性和不适用范围。促进检验与临床的沟通，促使检验更正确的应用。,Thanks for your attention！,
