1.第一章血液标本采集和制片12.8.ppt

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1、临床检验基础,临床检验教研室李新岳,一、医学检验发展史 基础。,医学检验奠基人 1673年列文霍克(ALeeuwenhoek)发明显微镜 他用自制显微镜发现了红细胞、细菌及原虫等。,概述,一、医学检验发展史 临床医学检验-实验诊断学,临床检验基础 临床生化检验 临床免疫检验 临床微生物检验 临床血液检验 临床输血检验 临床分子诊断学检验,临床医学检验,概述,二、医学检验现状和特点,医学检验是一门具有多学科理论交叉、应用性强、发展迅速的应用技术学科，是医学各科中发展最快的专业之一。,概述,（一）现状1、临床检验已进入仪器化时代：,电子技术和计算机在医学检验中得到了广泛应用，基础医学的重大进展促进

2、了实验诊断迅猛发展。标本用量少、减少标本的转运环节、更快速、更灵活、易操作、信息量大、易质控、报告及时。但是许多手工操作仍然是基础,是金指标,可校准仪器,是质量控制重要方法。,二、临床检验现状和特点,概述,2、工作任务的转变：,（一）现状 1、临床检验已进入仪器化时代：,由简单的为临床提供检验结果发展检验技术+参与临床咨询+临床诊断+治疗及预防工作,3、运用循证医学理论为临床提供合理的检验项目。,4、检验医师与临床医师共同制定诊断和疗效判断标准。,概述,1、检验操作的自动化：2、检验方法的标准化：3、检验技术的现代化：流式细胞术、生物芯片、分子杂交、PCR4、检验试剂的商品化：5、计量单位的国

3、际化：6、质量管理的全程化：检测前、中、后,（二）医学检验的特点,概述,7、生物安全的严格化：标本有潜在危险 严格遵循“实验室生物安全通用要求”、“临床实验室废物处理原则。8、检验人员的合格化：,（二）医学检验的特点,能做,能质控,能维护,能分析,期待检验医师能遵照和参与国家、国际标准化检验的实践活动，精通先进检验操作方法，并能与临床医生进行交流。,概述,三、医学检验的基本任务 运用物理学、化学、生物学、免疫学、自动化检验等技术，对人体的血液、体液、排泄物、分泌物和脱落细胞等标本进行实验室检查，以获得病原学、病理学和脏器功能状况等资料，为疾病诊断、治疗、病情观察、预后判断提供依据，并结合病史、

4、体格检查和其他各种辅助诊断资料，进行综合分析，以达到诊断明确、治疗及时和制定预防措施的目的。,概述,临床检验基础：是临床上最常用、最基本的检测方法，即运用现代分析技术、显微镜、物理学、化学、生物学、免疫学、遗传学等技术对人体血液、体液、分泌物、排泄物及脱落细胞等进行检验，以获得疾病病因、病理变化、器官功能状态等资料,协助诊断疾病的学科。是集微观形态学和宏观理化检验于一体综合性学科。,概述,四、临床检验基础的临床应用1、为疾病诊断和鉴别诊断提供客观依据2、为疾病疗效观察和预后判断提供动态变化依据3、为预防疾病提供检测依据4、为健康咨询提供依据5、为科学研究提供基本数据、基本检验方法和操作技能,概

5、述,五、学习的基本要求学习目的：1、掌握本学科基本技能，用准确、经济、简便、快速的检测方法获取检测结果 达到协助诊断疾病和预防疾病的目的 2、为探索准确、经济、简便、快速的检测方法，培养创新能力打下坚实的基础。,概述,五、学习的基本要求 1、掌握临检的基本理论,2、掌握各种操作技能,3、掌握方法学评价,4、熟悉各项实验的参考区间,6、加强职业道德培养 必须养成严谨、细心、有条不紊、一丝不苟、认真负责、实事求是的工作作风,树立优良的职业道德。,5、熟悉实验项目的临床意义,概述,五、学习的要求:7、勤学苦练基本技能和具有过硬的形态学本领,才能胜任工作,成为一个优秀的检验工作者。8、上课要同时带理论

6、教材和实验教材。9、实验课前要求预习实验指导；不无故缺课，实验考试不及格不准参加理论考试。本课程总课时学128时,其中理论64学时;实验64学时,第一章血液标本采集和血涂片制备,第一节 血液标本的采集,一、血标本类型（一）全血:血细胞+血浆 静脉全血、动脉全血、毛细血管全血（二）血 浆：全血血细胞（三）血 清：全血血细胞纤维蛋白原及其他凝血因子（四）分离或浓缩的血细胞,二、血标本采集的方法,第一节 血液标本的采集,皮肤采血 静脉采血法 动脉采血,采集部位,普通静脉采血真空采血法,凡用血量较少,0.1ml的检验项目，均可用此法采血。如：手工操作做 RBC、WBC、Hb、PLT等。婴幼儿血液分析仪

7、做血常规,第一节 血液标本的采集,二、血标本采集的方法（一）皮肤采血(毛细血管采血),二、血标本采集的方法（一）皮肤采血(毛细血管采血)1、采血部位：1）、手指：WHO推荐以左手中指或无名指尖内侧为宜。婴幼儿 半岁以上用手指,半岁以下用拇指或足底部内、外侧缘 烧伤病人 视具体情况选择皮肤完整部位采血或静脉血。,第一节 血液标本的采集,（一）皮肤采血：1、采血部位：1）手指：,第一节 血液标本的采集,2）耳垂：痛感较轻，操作方便，适于反复采血。缺陷：血循环较差，受气温影响较大，血细胞汁数和血红蛋白浓度等结果静脉血，且冬季波动幅度较大，已是淘汰。,（一）皮肤采血：2、采血器材（1）采血针皮肤采血法

8、 1）微量吸管：10ul、20ul刻度。2）采血针：用三棱针或专用“采血针”，用前须高压或煮沸消毒，为避免交叉感染应严格实行一人一支吸管和一根针。目前最好的是激光无痛采血仪。3）消毒用具：3、采血方法：略,第一节 血液标本的采集,（一）皮肤采血：4、注意事项：(1)采血部位应无水肿、冻疮、炎症、紫绀、溃疡。(2)注意消毒及用具一次性使用。(3)以血液自行流出为佳。可轻挤压,切忌用力挤压，以免组织液混入。(4)采血顺序为：PLTRBCHbWBC DC等。(5)若做出血时间测定,需另刺一针，不能拭去第一 滴血。凝血时间另外测定。,第一节 血液标本的采集,第一节 血液标本的采集,激光皮肤采血法（1）

9、器材：激光采血器、一次性激光防护罩、微量吸管、消毒用品（2）方法：,第一节 血液标本的采集,激光皮肤采血法（3）注意事项：禁止在有易燃易爆气体环境中操作，以免引起爆炸事故；禁止用肉眼观看激光窗口或将激光窗口对准身体其他部位；防护罩要紧贴采血部位，以免影响标本采集效果；激光采血器的透镜部分应经常清洁。,（二）静脉采血法 1、普通静脉采血 凡需血量较多（0.2ml）的检验项目，用此采血法，如：多项血细胞分析、压积、血沉等。采血部位：肘前静脉为主，亦可用手背部、手腕部和外踝部静脉。幼儿用颈外静脉采血。,第一节 血液标本的采集,（二）静脉采血法 1、普通静脉采血注意事项 严格无菌操作，止血带压迫时间不

10、超过1min,抽血时避免气泡。以检查项目要求选择是否空腹采血。出血性疾病要用硅化或塑料注射器和试管。应拔下注射针头后,将血沿试管壁注入试管。,第一节 血液标本的采集,2、真空采血法 又称负压采血法。真空采血装置有套筒式、头皮静脉式。封闭式采血无需容器之间转移，减少了溶血现象，同时样本转运方便，避免医患间的交叉感染。根据需要不同，不同检验项目，在真空管上标有不同颜色。,第一节 血液标本的采集,盖子颜色 添加抗凝剂 注意事项 用 途红色 无 凝块形成约需30min 化学、血清学、血库紫色 EDTA 须颠倒混匀68次 全血细胞计数(CBC)淡蓝色 枸橼酸钠 须颠倒混匀；血液与抗 凝血检查(PT、AP

11、TT、凝剂比例为9:1 因子测定)绿色 肝素钠、肝素锂、根据实验需要选择不同 化学 肝素铵 类型的肝素灰色 氟化钠、草酸钾 不能用于其他化学检查 葡萄糖、糖耐量、乙醇 浓度黄色 多茴香脑磺酸钠 须颠倒混匀8次 血培养(SPS)深蓝色 无抗凝剂或肝素 化学清洁的试管 毒理学、微量金属 钠、EDTA金黄色 分离胶凝块激 须颠倒混匀5次，使血液 化学，不适于血库 活剂 与激活剂充分接触。凝块完 全形成后离心淡绿色 分离胶肝素锂 钾测定桔黄色 凝血酶 须颠倒混匀8次 化学黑色 枸橼酸钠 血液与抗凝剂比例为4:1 血沉棕色 肝素钠 铅浓度0.1ugml 铅测定粉红色 无 血库,三、血液标本的抗凝,抗凝：

12、应用物理的或化学的方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，称抗凝。抗凝剂（物质）：能够阻止血液凝固的化学试剂或物质。,P10 表1-3,三、血液标本的抗凝,（一）枸橼酸钠 机理：与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。浓度：109mmol/L(32.0g/L)，106mmol/L(30.8g/L),（一）枸橼酸钠 用途：1.止凝血象检查，血液保养液用109mmol/L按1:9比例。2.血沉测定，用106mmol/L与血按1:4比例。（ICSH国际血液学标准化委员会推荐）缺点：不适于血细胞计数。,三、血液标本的抗凝,（二）草酸钠：机理：可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，阻止血凝固

13、。浓度：0.1mol/L，与血按1:9比例混合。用途：出凝血性疾病 缺点：不能作血涂片，因可产生草酸盐结晶，还可使淋巴细胞核出现“三叶式”改变或红细胞出现棘形。,三、血液标本的抗凝,（三）双草酸盐：草酸钾+草酸铵 机理：与钙离子形成草酸钙沉淀达到抗凝。配制：100ml抗凝剂中含草酸钾0.8g，草酸铵1.2g取此液0.20.5ml于小瓶内80以下/烘干可使25ml血不凝。80草酸酸盐可被分解为碳酸盐而失效。,三、血液标本的抗凝,（三）双草酸盐：草酸钾+草酸铵 用途：草酸钾盐或钠盐可使红细胞体积皱缩（约11%）。草酸铵可使红细胞胀大。二者适当混合不影响红细胞形态和体积如：红细胞比积，血细胞计数，网

14、织红计数等，抗凝以后小时结果可靠。缺点：草酸盐可引起血小板聚集，并可影响白细胞形态故不适用于血小板计数和白细胞分类计数。,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：肝素广泛存在于肺、肝、脾等几乎所有组织的血管肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：机理：1.与抗凝血酶(AT-)一起，在低浓度能抑制因子IXa、和PF3之间的作用，阻止凝血酶形成。2.加强抗凝血酶(AT-)灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成 3.抑制凝血酶的自我催化抑制因子的作用。4.高浓度时可阴断凝血酶与纤维蛋白的反应,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：配制：肝素粉（每mg含100125单位），配成1g/L水溶液

15、取0.5ml置小瓶中，放3750烘干，可抗凝血5ml。,三、血液标本的抗凝,三、血液标本的抗凝,（四）肝素：用途：肝素具有抗凝能力强，不影响血细胞引起溶血等优点，为一种较好的抗凝剂。红细胞计数，血红蛋白测定，红细胞比积及多种生化分析。也是抗血栓药物之一。缺点：过量肝素会引起白细胞凝集和血小板减少，故不能用于白细胞计数，血小板计数。肝素抗凝血瑞氏染色后背景呈是深兰色，影响镜检，故也不适于作DC。,三、血液标本的抗凝,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：机理:与血中钙离子结合成螯合物,阻止血液凝固.配制：ICSH建议其使用浓度为每毫升血1.52.2mg。实验室常将其配成15g/L，取0.5ml100

16、，烘干，可抗凝血5ml。,三、血液标本的抗凝,用途：适用于多项血液学检查 血细胞计数（特别是血小板计数）红细胞比积测定（室温下48h内红细胞比积不改变）,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：,三、血液标本的抗凝,（五）乙二胺四乙酸（EDTA）盐：缺点：1.影响血小板聚集和白细胞吞噬功能，不适于出血凝血检查及血小板功能检验。2.能影响某些酶的活性和抑制红斑狼疮因子，故不适于制作组化染色和检查红斑狼疮细胞的血涂片。,三、血液标本的抗凝,（六）脱纤维蛋白法（物理抗凝）：方法：将血液注入有玻璃珠的盛器中不停转动，使纤维蛋白缠绕凝固于玻璃珠上，从而阻止血凝固。或用棉签挠。用途：适用于免疫学检查和红斑狼疮细

17、胞检查。,四、血标本的运送、保存与处理 血标本处理的基本原则 把每一分标本当作无法重新获得的唯一标本,加以小心运送、保护、保存、检测和报告；要视每一分标本都有传染性,对高危标本要注明标识；严禁用口吸标本,避免标本污染皮肤和实验台；检验完毕,标本必须消毒处理,容器要消毒、毁型或焚烧。,四、血标本的运送、保存与处理（一）血液标本检测前预处理分离血清、分离血浆、分离血细胞（二）血液标本运送 遵循：唯一标识原则、生物安全原则、及时运送原则,四、血标本的运送、保存与处理（三）血液标本拒收 溶血、容器不当、标本量不足、转运不当、申请单标识不清、标本污染或破损均要拒收（四）血液标本保存 按要求分为室温保存、

18、冷藏保存、冷冻保存 立即送检标本：血氨、血沉、血气分析酸性磷酸酶、乳酸等。（五）检测后标本处理 原则：将危险减至最小、对环境危害减至最小,第二节血液标本采集质量保证,一、采血环境要求与生物安全 1、环境要求：环境应舒适、宽敞、明亮通风、有足够的采血窗口。2、生物安全：防止交叉感染，履行环境消毒。,血液标本的采集是分析前质量控制的重要环节之一,第二节血液标本采集质量保证,二、标本的采集的一般要求（一）检验申请单（二）标本采集和处理具体要求 患者告知、患者准备说明书、标本采集类别和数量、标本采集日期和时间、标本处理要求、标本采集人员、标本采集器材和安全处理。（三）标本信息完整性与接收 对特殊标本处

19、理、急危重病人标识、规定时间内送检、注意物理条件对标本影响、标本归档记录、接收记录等,第二节血液标本采集质量保证,三、血液标本采集及检测结果的影响因素 1、患者生理状态和饮食的影响 标本采集时的活动情况、精神状态、饮食、吸烟、等都影响结果(见p12表1-5),、药物对检验结果影响:影响反应系统待测成分的物理性质；参与检验化学反应；影响机体生理功能和细胞活动的代谢；对器官的药理活性和毒性作用。,第二节血液标本采集质量保证,3、采血操作对检验结果的影响（1）采血的时间 应尽可能上午9时前空腹采血，应尽可能检查和治疗前采血（）采血部位 1)皮肤采血：避开炎症、化脓、冻伤等处；2)静脉采血:选择大而浅

20、表的大血管。,第二节血液标本采集质量保证,3、采血操作对检验结果的影响（3）采血体位：直立比仰卧血液浓缩，细胞计数和大分子增高。（4）止血带压迫时间：不超过1min，过长将引起血液浓缩，成分改变，影响结果。,第二节血液标本采集质量保证,4、其他（1）输液：（2）避免溶血：（3）抗凝剂对标本影响（4）低温保存对标本的影响 血液分析仪测定抗凝血标本不宜低温保存，低温可使血液成分及细胞形态发生变化；室温保存时间不能超过6h，冰冻标本不宜反复冻融，解冻后应完全融化、混匀后应用。,第三节血涂片制备和染色,一、血片制备（一）载玻片的清洁、新玻片用1mol/L（10）Hcl浸泡24h清水彻底冲洗烤干后备用。

21、、用过的玻片用肥皂水煮沸20min趁热将血膜刷洗干净清水反复冲洗。,第三节 血涂片制备和染色,（二）制血片：推片法于载玻片1/3与2/3交界处加绿豆大血1滴,左手拇指与中指持载玻片(血滴靠中指端),右手持边缘平滑的推片,从血滴前方接触血液使血液散开成一线 以推片与载片保持2530度夹角向前(母指方向)推动形成血膜,(三)良好涂片标准,(1)呈头、体、尾分明的舌形 外观(2)血膜均匀一致，厚薄适宜(3)两边留有空隙(较大细胞常在边缘),(1)血滴大小(2)推片与玻片之间角度(3)推片速度,二、血涂片染色,常用染色方法有：瑞氏染色法、姬姆萨染色法、瑞姬氏染色法(一)瑞氏染色法（right)【原理】

22、1、瑞氏染液组成：瑞氏粉+甲醇,(1)瑞氏粉的组成：美蓝的氯盐+伊红的钠盐+水 瑞氏粉沉淀(ME)瑞氏粉不溶于水，而溶于甲醇,二、血涂片染色,(2)瑞氏粉的性质：是一种中性盐（伊红E、美蓝M），难溶于水，可溶于甲醇并解离,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：(1)瑞氏粉的组成：,ME(瑞氏粉)甲醇M+E-瑞氏染液 美蓝氧化后-天青(紫红色),二、血涂片染色,2、甲醇作用：固定血膜片（具强大脱水力）,防止细胞溶解；增加染色效果；使细胞粘附于玻片 溶解瑞氏粉，起溶剂的作用：过多瑞氏液或染色过久反可使细胞不着色。,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：,二、血涂

23、片染色,3、细胞对染液的反应：染色过程中既有物理吸附作用又有化学亲和力作用（各类细胞和细胞的各种成份,化学性质不同，对染液亲和力不同对各染料可发生不同的化学 结合）。因而在染色后同一张血膜上，可以看到不同的着色，从而区分各细胞。,(一)瑞氏染色法（right)【原理】1、瑞氏染液组成：2、甲醇作用：,二、血涂片染色,3、细胞对染液的反应：带正电的蛋白质(细胞内碱性物质)与带负电的酸性伊红结合，而染成红色 如：红细胞浆内Hb，嗜酸性颗粒等均 带负电的蛋白质(细胞内酸性物质)将与带正电的碱性美蓝结合,而染成深蓝色 如：细胞核(DNA)、原始细胞浆（含RNA），嗜碱性颗粒等均为性酸性物质。中性物质既

24、能与伊红结合，又能与美篮结合,而染成粉红色、淡紫红色。如：嗜中性颗粒。,二、血涂片染色,4、PH值对细胞着色的影响:当溶液PH pI:偏碱 负电荷增多(OH)，易与带正电的美蓝结合 染色偏蓝。,a.玻片必须化学清洁（洗衣粉）；b.用PH6.46.8缓冲液或新鲜蒸馏水调节PH；c.染色完后应用近中性水冲洗。,二、血涂片染色,【试剂】瑞氏染液、pH6.46.8磷酸盐缓冲液【染色方法】略,【瑞氏染色结果判断】,正常染色,偏酸,偏碱,【瑞氏染色注意事项】,()未干透血膜，染色时易脱落，故血膜应干透再染色。()染色时间与染液浓度，室温高低，细胞多少有关。()冲洗前，先在低倍镜下观察有核细胞是否着色。否则

25、适当延长时间。()染液不能过少，以防蒸发，染料沉着在血膜上不易冲掉，影响观察。染料缓冲液。,【瑞氏染色注意事项】,()冲洗时，应以流水冲去，防染料沉着。()染色应注意保存血片尾部，不能用蜡笔划去，因体积大的细胞常在此出现。()若要复染,应先加缓冲液后再加染液，或加已混合好的。()染色过深可用水冲洗或浸泡一定时间，或用甲醇 退色。,（二）姬姆萨染色法,原理与Wright染色法大致相同,姬姆萨染料由天青和伊红组成【评价】:(1)本法对细胞核和疟原虫染色较好(2)对细胞质和颗粒较差,(三)瑞-姬氏染色,瑞-姬氏染色液=瑞氏粉1g甲醇500ml+姬氏粉0.3g【评价】兼有上述两法的优点,染色效果更好、快速。,