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1、常州贺利氏医疗器械有限公司初始污染菌方法检查验证方案编制: 日期： 审核： 日期：批准： 日期：初始污染菌检查验证方案目 录1. 验证目的2. 参照标准3. 验证项目4. 验证小组及职责5. 合格标准6. 试验材料：7. 菌液制备 8. 菌液计数9. 培养基的制备10.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证11.菌回收率计算公式12.结果及结论1. 验证目的：建立本公司医疗器械产品表面微生物限度检查方法，本公司产品初始污染菌系采用平皿法 现对该方法进行验证，以确认该方法适合于产品表面初始污染菌的检查。2. 参照标准：2010版中国药典二部附录XI J微生物限度检查法。3. 验证项目：本公司医疗器械产
2、品表面微生物限度检查。4.验证小组人员及职责：4.1验证小组人员:小组人员职务姓 名所在部门职 务组 长巢雪芬质量部部门负责人组 员吴海双质量部专职检验员组 员秦亚芬质量部专职检验员4.2验证人员职责及要求4.2.1按验证方案及相关文件实施验证。4.2.2认真观察并做好验证原始记录。4.2.3对实施验证的结果负责。4.3验证中各部门的职责4.3.1验证领导组职责4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。4.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。4.3.1.3负责验证方案的批准工作。4.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。4.3.1.5负责验证报告的批准工作。4.3.2验证工
3、作小组职责4.3.2.1负责验证方案的起草工作。4.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。4.3.2.3负责验证方案的实施。4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。4.3.2.5参与验证结果的评价工作。4.3.3质量部职责4.3.3.1负责公司验证日常管理工作。4.3.3.2负责验证方案的审核工作。4.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。4.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。4.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。4.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。4.3.3.7负责验证资料和报告的审核
4、工作。4.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。5. 合格标准：实验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。6. 试验材料：6.1. 被验证产品：本公司医疗器械产品吻合器6.2. 仪器设备：6.2.1 YXQ-LS-18SI型手自动提式灭菌器6.2.2 YJ875SDA型 净 化台 6.2.3 MJX-100B-Z型霉菌培养箱 (2328)6.2.4 HPX-9162MBE数显式恒温培养箱 (3035)6.2.5 202-OA型电热恒温干燥箱6.3. 验证用培养基 名称生产厂家批号营养肉汤培养基上海中科昆虫生物技术开发有限公司110429改良马丁培养基上海中科昆虫生物技术开发
5、有限公司100415改良马丁琼脂培养基上海中科昆虫生物技术开发有限公司101203玫瑰红钠琼脂培养基上海中科昆虫生物技术开发有限公司1105266.4. 验证用菌株：(第 代)验证菌株培养基培养温度培养时间（小时）大肠埃希菌营养肉汤30351824金黄色葡萄球菌营养肉汤30351824枯草芽孢杆菌营养肉汤30351824白色念珠菌改良马丁培养基23282448黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基232857（天）7. 菌液制备 7.1. 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于3035培养1824小时。取经3035培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯
6、草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-610-7约为50100cfuml的菌悬液备用。7.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于2328培养2448小时。取经2328培养2448小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50100cfuml的菌悬液备用。7.3.接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.
7、05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfuml的菌悬液备用。8.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别取1ml接种至营养琼脂培养基中，置3035培养48小时；白色念珠菌、黑曲霉分别取1ml接种至玫瑰红钠琼脂培养基，置2328培养72小时。菌落计数结果（2个平皿计数取平均值）见下表菌落计数结果（cfuml）试验次数10-5稀释10-6稀释10-7稀释123123123大肠埃希菌797573金黄色葡萄球菌556263枯草芽孢杆菌667263白色念珠菌747577黑曲霉5553569.培养基的制备 取配好的营养
8、琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，加热至液态，倒入已灭菌的培养皿中约15-20ml，冷却。10.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）每次试验的回收率。10.1试验组 分别取样品1ml（注：我公司医疗器械是硬件产品，加20ml无菌氯化钠进行洗脱）和50100cfu的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌），分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基中，每珠试验菌平均倾注2个平皿，于3035培养3天。 分别取样品1ml（注：我公司医疗器械是硬件产品，加20ml无菌氯化钠
9、进行洗脱）和50100cfu的试验菌（白色念珠菌、黑曲霉），分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基中，每珠试验菌平均倾注2个平皿，于2328培养5天。10.2菌液组 取3份营养琼脂培养基分别向里面加入含50100个/ml菌（CFU）的金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液。另取2个玫瑰红钠琼脂培养皿加入含50100个/ml菌（CFU）的白色念珠菌、黑曲霉菌。10.3供试品对照组 取样品2ml分别注入营养琼脂培养基中于3035培养3天和玫瑰红钠琼脂培养基中于2328培养5天。10.4稀释剂对照组 取无菌氯化钠3ml和50100cfu的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢
10、杆菌），分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基中，每珠试验菌平均倾注2个平皿，于3035培养3天。 取无菌氯化钠2ml和50100cfu的试验菌（白色念珠菌、黑曲霉），分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基中，每珠试验菌平均倾注2个平皿，于2328培养5天。 11.菌回收率计算 试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数 11.1试验组的菌回收率（%）= 100% 菌液组平均菌落数 稀释剂对照组平均菌落数11.2稀释剂对照组的菌回收率（%）= 100% 菌液组平均菌落数12.结果见附录附表1：试验时间 2012 年 3 月 20日 完成时间 2012 年 3月 26 日验证菌株试验组(回收率
11、)菌液组供试品对照组稀释剂对照组（回收率）金黄色葡萄球菌(培养3天计数)53（89.5%）57254（94.7%）61（93.8%）64162（96.9%）51（89.1%）55253（96.4%）大肠埃希菌(培养3天计数)72（95%）76271（93.4%）75（93.7）79177(97.5%)77（95%）80178(97.5%)枯草芽孢杆菌(培养3天计数)62(89.6%)67261(91%)63(90%)70062(88.6%)67(91.7%)72167(93.1%)白色念珠菌(培养5天开始计数)73(91%)78272(92.3%)68(93.1%)72165(90.3%)65(85.3%)75169(92%)黑曲霉菌(培养5天开始计数)50(92.6%)54049(90.7%)51(84.7%)59153(89.8%)51(91.1%)56052(92.9%)结论本次试验各试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%，按标准规定，本次试验结果符合规定。试验人 复核人
