药物的含量测定.ppt

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1、四川理工学院,第六章 药物的含量测定,药分 制药2011,第一节 概述,药物的含量测定,评价药物质量的主要指标。运用化学、物理或生物化学的方法和技术，测定药物中主要有效成分的含量。,定义,药物的含量测定,化学、物理学、生物学方法,方法,利用某些生物学特性或特殊反应来定性、定量,化学反应,如光吸收特性、浊度,药物的含量测定,基于化学或物理学原理的含量测定。,分两类,基于生物学原理的效价测定。,基础,生物检定法，微生物检定法，酶法。,目标,含量测定。,含量方法要求,化学原料药（API)：根据药物的化学结构、理化性质等特点综合考虑适宜的含量测定法。选用的含量测定法应能准确测试有效成分的含量，其准确度

2、和精密度均高。制剂：可能时应选用与原料药相同的测定方法，共存药物、辅料、附加剂有干扰时，可考虑增加预处理或改进方法,但专属性要强。,含量表示方法,（一）原料药含量的表示法原料药一般以百分含量表示，指样品中被测成分（一般为活性物质）的百分含量。一般按干燥品计算。药典凡例规定：“按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算”时，除另有规定外，应取未经干燥（或未去水，或未去溶剂）的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重（或水分，或溶剂）扣除。,因此：含量%（干燥品计）=直接测得量（1-干燥失重）,（二）药物制剂含量的表示法一般以相当于标示量的百分数表示，指一个制剂单位中平均含有的药物成分为

3、制剂标准的“规格”项规定量的百分数。如：对乙酰氨基酚片，规格0.5g，经含量测定测得平均每片含对乙酰氨基酚0.45g，则标示量为90%。,固体制剂含量测定结果的计算,原料药,制剂,物质的量 效价 生物学法（基于生物学原理）,药物含量测定方法,化学法（基于化学原理）容量分析法、重量分析,仪器分析法（基于物理学原理）光谱法、色谱法,具体方法,容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、间接滴定法）光谱分析法：UV、IR、色谱分析法：HPLC、GC,第二节、容量分析法,为经典方法，原料药分析常采用。,常产生滴定误差，如指示剂和仪器容量,特点：1、快速,准确（RSD0.2）,灵敏度高；2、适合于中、高含

4、量组分分析（1%）；3、仪器简单，操作方便，适用范围广；,按滴定方式分：,容量分析法分类,滴定度（T）：每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg),酸碱滴定：在水溶液中以酸碱中和反应来测定物质含量的方法配位（络合）滴定法：以形成稳定配合物的配位反应为基础的滴定分析法。用于金属离子的测定 采用金属指示剂（如铬黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二钠）氧化还原滴定法：碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸钠滴定液、淀粉指示剂 溴量法：Na2S2O3滴定液、Br2滴定液,按反应类型分：,沉淀滴定法：以沉淀反应为基础，多以硝酸银为滴定液，也称银量法。按所用指示剂的不同分为铬酸钾指示剂法铁铵矾指示剂法吸附指

5、示剂法非水滴定法：在非水溶剂（有机溶剂与不含水的无机溶剂）中进行滴定分析的方法。非水碱量法：是以冰醋酸为溶剂，高氯酸为滴定液，甲紫微指示剂，测定弱碱性药物及其盐类 非水酸量法：是在碱性溶液中，以甲醇钠为滴定液，麝香草酚蓝为指示剂，二甲基甲酰胺等为溶剂，滴定弱酸性药物,滴定法的计算,滴定度(T)的计算 在容量分析中，被测药物(B)与滴定液(A)之间都按一定的摩尔比进行反应的，滴定反应可表示为：,aA(待测物）bB（滴定液）cCdD,滴定液反应的质量,被测药物反应的质量,被测药物的摩尔质量,滴定液的摩尔质量,m滴定液浓度(mol/L)M被测物质分子量a/b 为反应式配平后滴定液与被测物的摩尔比,T

6、=（a/b）mM,示例一 计算Vc的滴定度T,碘量法测定Vc含量M(C6H6O6)=176.13，C(I2)=0.05mol/L,Mb=0.05mol/L,1,1,MA=176.13,示例二 异烟肼的滴定度,溴酸钾法测定异烟肼含量M(C6H7N3O)=137.14，C溴酸钾=0.01667mol/L,a,b,直接滴定法计算公式,在实际工作中，滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致，所以应该进行校正,先计算T,再计算含量,正确求a和b,剩余滴定法计算公式,也叫回滴定法，本法常需空白试验，含量测定结果的计算：,例题：非那西丁含量测定：精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸

7、钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N。计算非那西丁的含量为？,例：精密称取青霉素钾供试品0.4021g，按药典规定用剩余碱量法测定含量。先加入氢氧化钠液(0.1mol/L)25.00ml，回滴时消耗0.1015mol/l的盐酸液14.20ml，空白试验消耗0.1015mol/l的盐酸液24.68ml。求供试品的含量，每1ml氢氧化钠液(0.1mol/L)相当于37.25mg的青霉素钾。,例非那西丁含量测定：精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）

8、滴定，用去20.00m1。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N。计算非那西丁的含量为（）A.95.55%B.96.55%C.97.55%D.98.55%E.99.72%,光谱分析法,药典收载,紫外可见分光度法,原子吸收分光光度法,红外分光度法,荧光分析法,火焰光度法,第三节 分光光度法,分光光度法:是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。光是电磁波,常用的波长范围为：(1)200400nm-紫外光区；(2)400760nm-可见光区；(3)7602500nm（12800cm-14000cm-1

9、）-近红外光区(4)2.525m（按波数计为4000cm-1400cm-1）-红外光区。,紫外可见分光度法,方法特点与适用范围,1、简便易行：本法使用的仪器价格比较低廉，操作简单，易于普及,2、灵敏度高：本法灵敏度可达10-710-4g/ml，适用于低浓度试样分析,3、准确度较高：本法误差在2%5%之间，适用于对测定结果的准确度要求较高的样品,4、专属性较差：本法通常不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。,本法比较少应用于原料药的含量测定，可用于制剂的含量测定，更多的应用于生物制剂的定量检查,本法紫外区须选用石英比色皿，比色皿一般为1cm，吸光度在0.30.7之间为宜，选用最大

10、吸收光波长。,紫外-可见分光光度法,物质吸收紫外和可见光区的电磁波产生的吸收光谱 进行定性和定量分析的方法 1.基本原理：朗伯比耳定律 A为吸收度；T为透光率；L为液层厚度，单位为cm；E为吸收系数，常用的是百分吸收系数和摩尔吸收系数表示；C为100ml溶液中所含被测物质的量g,吸收系数,2.仪器的基本结构钨灯（612V），产生3203200nm的连续光谱，其适宜的波长是3601000nm。氢灯发射150400nm波长的光，适用于200400nm波长。,（2）吸收度的准确度 吸收度的准确性用基准重铬酸钾硫酸溶液检定60mgk2Cr2O7,释稀1000ml，在规定波长处测定吸收度，计算吸收系数E

11、，相对误差度在1%以内。（3）分辨率测定,（1）波长的准确度,3.仪器的校正和检定,中国药典2010版对吸光度的测定做了以下要求：（1）溶剂：要求：能溶解样品，挥发性小，对光波吸收少。,4.吸光度的测定,（2）空白试验校正：采用空白对照，将溶剂装入吸收池，放入光路调节，仪器使吸收度为0（或透光率100%），然后再测样品。（3）测定波长的核对：为了提高测定灵敏度，减少测定误差，吸收度一般应在 测定，测定样品的与文献记载对照，应在规定波长2nm以内。（4）供试品溶液的浓度：为了减少误差，应考虑使吸光度在0.30.7范围内,（）对照品比较法：（）吸收系数法：（）标准曲线法：,5.含量测定：,(1)对

12、照法,(2)吸收系数法计算,(3)标准曲线法,配制系列浓度的对照品溶液，在max处测吸收度A，做吸光度浓度曲线，测试样品时，根据A在标准工作曲线上查C。,（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。（3）在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池34次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损），放入样品室每次方向应一致。（4）取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用

13、干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。若吸收池内外壁沾污，用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻擦试，再用纯化水冲净。（5）仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，并应经常校准波长精度。,6.注意事项,特点：灵敏度高，可达10-1010-12g/ml 要求低浓度下测定 须做空白测定 荧光弱的药物可衍生化后测定,二、荧光分析法,第四节 色谱分析法,色谱法：是一种物理或物理化学分离分析方法。分离机制：分配、吸附、离子交换、分子排阻及亲合色谱法优点：高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快、应用范围广。应用：各国药典中广泛用作纯度检查、含量测定。分类：流动相：气体气相色谱法 液体液相色谱

14、法 固定相：固体或液体 气固色谱法；气液色谱法；液固色谱法；液液色谱法 操作形式：柱色谱法、平板色谱法、电泳法,一、HPLC色谱法及定量方法,（一）主要参数：1.基线：没有样品进入检测器时，噪音随时间的变化。2.保留时间tR：从进样到组分色谱峰顶点的时间,3.峰高h/峰面积：从最高点到基线的距离（峰与基线围成的面积）。4.峰宽W：拐点作切线在基线上的载距。W越窄柱效高。5.半峰宽Wh/2点：峰高一半处的峰宽。6.理论塔板数：n=5.54(tR/wh/2)2，一般n103，n越大柱效高,7.分离度 R2（tR2tR1）/（W1W2）R1.5 认为分离完全,（二）基本原理 待分离物质在两相间进行分

15、配时，在固定相中溶解度较小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱1.正相色谱法 流动相极性小于固定相一般用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相，主要用于分离极性化合物，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。2.反相色谱法 流动相极性大于固定相一般用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相，主要用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。,（三）固定相和流动相,1.固定相 常用化学键合相，分极性和非极性键合相，

16、如十八烷基硅烷键合硅胶（C18或ODS）和辛基硅烷键合硅胶（C8）为最常用的非极性键合相，用于反相色谱法；氨基和氰基硅烷键合相为常用的极性键合相，用于正相色谱法。2.流动相 有机溶剂+水混合一般为色谱纯试剂，经0.45um的微孔滤膜过滤，需脱气处理,（四）仪器的基本结构,1.色谱柱,柱管-不锈钢，填充硅胶和化学键合固定相 内径4.6mm长15cm、20cm和25cm的三种，如安捷伦色谱柱、Waters色谱柱、迪马色谱柱等。,2.检测器,常用紫外检测器其次有二极管阵列检测器(DAD)荧光检测器示差折光检测器蒸发光散射检侧器电化学检测器和质谱检测器等,（五）系统适用性试验,定义：指用规定的对照品对

17、色谱系统进行试验，应符合要求。包括柱温、柱长、固定相、流动相；理论板数：说明分离过程，色谱柱的塔板数越多，柱效越高；分离度：应大于1.5；重复性：相对标准偏差应不大于2.0%；等；,（六）在杂质检查和含量测定中的应用,1.内标法（加校正因子）方法：内标物+对照品对照溶液，进样，测定，计算校正因子。,CR对照品浓度,As内标物峰面积,CS内标物浓度,AR对照品峰面积,供试品+内标供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量,Cx样品浓度,Ax样品峰面积,例.HPLC法测定盐酸阿夫唑嗪片（规格：5mg）的含量：取盐酸特拉唑嗪约20mg，称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释

18、至刻度，摇匀，得内标溶液。取盐酸阿夫唑嗪对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，精密取该储备液1ml，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液；另取本品20片，精密称定，研细，精密称细粉适量（约相当于阿夫唑嗪10mg），置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得样品溶液。分别精密取对照品溶液和样品溶液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算含量。,操作：对照品取样为10.

19、1mg，20片重为1.6020g，取样细粉称重158.2mg，测得对照品溶液中盐酸阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为5470124和6126012，样品溶液中阿夫唑嗪和内标的峰面积分别为5219986和61198978，计算本品的含量。,解：对照品浓度：0.0101mg/ml,内标浓度：0.01mg/mgf=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(5470124/0.0101)=1.13 CX=fAX/(AS/CS)=1.135219986/(6119898/0.0100)=0.009735mg/ml=（0.00973510010/158.2)（1.6020/20）/5100

20、%=98.58%,例.HPLC法测定单硝酸异山梨酯注射液（规格：5ml:20mg）的含量：取间三甲氧基苯约20mg，称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得内标溶液。取单硝酸异山梨酯对照品约8mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品2ml，同法测定，按内标法以峰面积计算含量。已知：对照品取样为8.1mg，测得对照品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品溶液中单硝酸异山梨酯和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量。,解：

21、f=(AS/CS)/(AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07 CX=fAX/(AS/CS)=9.075221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml,=(0.7735100/5)2/20100%=96.68%,2.外标法,对照液（R）：AR CR,供试液（X）：AX CX,CX CR,AX AR,CX,CR AX,AR,要求：进样量准确、操作条件稳定,A总=Ai=A1+A2+An(%)=Ai/A总100%例题7 用气相色谱法检查大豆油的脂肪酸组成，相应于棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的峰面积分别为129758、43286

22、、296522、654868、92570，按峰面积归一化法，计算上述脂肪酸的百分含量。,3、面积归一化法,二、气相色谱法,1.分离原理注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。,2.色谱仪的基本结构由载气源、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成,.载气（流动相）：,如氦、氮和氢等.进样器：直接进样或顶空进样 微量注射器,.固定相和载体 色谱柱为填充柱或毛细管柱 常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

23、,毛细管柱填充柱,.检测器 火焰离子化检测器（FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器（NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS),.色谱系统适用性和含量测定中的应用同高效液相色谱法,第五节 药品含量测定方法验证,1 专属性 2 线性及其范围 3 精密度 4 准确度 5 检测限 6 定量限 7 耐用性,一、专属性(Specificity),指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰的一种方法。,A-对照品,B-样 品,C-阴 性,二、线性与范围(Linearity And

24、Range),线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。Y=a+bx（r0.999)范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。eg.原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%120%；制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%130%，根据剂型特点，如气雾剂、喷雾剂，范围可适当放宽；溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的20%,1、定义：在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。,三、精密度,2、表示方法：偏差（d）：标准偏差(SD):相对标准偏差(RSD):,重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度

25、至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。中间精密度:同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度目的：考察随机变动因素的影响，如日期、分析人员重现性:不同实验室，不同人测定的精密度当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，结果应记载在起草说明中。,四、准确度,1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。,2、测定法：用百分回收率（R）表示，测定回 收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”,（1）回收试验法 空白B+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,（2）加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,R=,测得量-本底量,加入量,100%,方法回收率通常要求达到,目视法信噪比法 S/N=3,五、检测限(Limit of Detection,LOD),药物能被检出的最低浓度(g/ml),六、定量限(Limit of Quantitation,LOQ),药物能被定量测定的最低浓度(g/ml),信噪比法 S/N=10,影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等,七、耐用性(Robustness),指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度。,