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1、高效液相色谱 High performance liquid chromatography(HPLC),1,概述,1.高效液相色谱法在色谱分析中的地位2.仪器介绍&工作原理3.影响检测结果的因素4.常用术语5.以药代动力学为例做方法介绍,2,仪器分析应用领域 application fields of instrument analysis,社会：体育（兴奋剂）、生活产品质量（鱼新鲜度、食品添加剂、农药残留量）、环境质量（污染实时检测）、法庭化学（DNA技术，物证）化学：新化合物的结构表征；分子层次上的分析方法；生命科学：DNA测序；活体检测；环境科学：环境监测；污染物分析；材料科学：新材料，
2、结构与性能；药物：天然药物的有效成分与结构，构效关系研究；外层空间探索：微型、高效、自动、智能化仪器研制。,3,水质监测、环境监测,药代动力学、血药浓度测定,疾病预测,HPLC,4,高效液相色谱仪模式图,5,色谱法：,又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。,6,色谱法分类,固定相状态,分离原理,吸附色谱分配色谱(液液）离子交换色谱排阻色谱 亲和色谱,7,常用色谱,8,9,仪器设备,10,高效液相色谱仪模式图,11,检测器,12,紫外-可
3、见光（U V-V I S）检测器,被测组分对紫外光有吸收，流动相无吸收，或与被测组分的吸收不同。,示差检测器（RI),连续检测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度,荧光检测器,某些物质受紫外光激发后，能发射可见光的性质进行检测,13,蒸发光散射检测器色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（N2）喷成雾状液滴。在蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，溶质形成不挥发细小颗粒，被载气载带通过检测系统。,仅能测定有电解活性物质&流动相有电导性,电化学检测器,14,检测器,15,进样系统,阀进样系统,自动进样系统,16,输液系统,泵（双泵头&加脉阻尼器）,流量：稳定、流量范围宽(输液泵的最 大流量
4、一般为5-10mL/min。)耐高压：输出压力高、密封性好；死体积：泵死体积小、耐腐蚀性好。,流动相（复杂样品，梯度洗脱）,17,色谱柱,柱效高、柱容量大、性能稳定,18,载体/固定床,载体/固定床,组分,分离,色谱：分离分析手段，可用于定性、定量测定,检测器,检测（电信号）,流出时间：分析特性电信号大小：定量,19,分离机制,本质上讲，是组分的分子在固定相及流动相分子之间相互作用的差异造成的。,分配系数K被分离组分在固定相与流动相中溶解达到平衡时的浓度比是一个常数。分配系数（K）,容量因子K：间接描绘分配系数。（量）K最佳值为2-5,20,梯度洗脱,多成分的复杂样品的分离时：,前面的成分分离
5、不完全，,后面的成分分离度太大，出峰很晚和峰型较差。,为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，用到梯度洗脱技术。,21,高压梯度洗脱,低压梯度洗脱,22,进样系统,进样时间,进样体积,样品浓度,不易过大,进样装置死体积,23,正相色谱VS反相色谱,24,流动相的选择,25,死时间，保留时间，调整保留时间,常用术语,死时间（dead time,t0）在固定相上不保留组分的保留时间，即溶剂分子的洗脱时间。死体积（dead volume，VM）死时间内流出的液体体积。即柱中所含的流动相体积。保留时间（retention time，tR）从进样开始到某个组分的色谱峰顶点时间
6、间隔，即从进样到柱后某组分出现浓度极大点的时间间隔。调整保留时间（adjusted retention time，tR 1）tR t0,26,基线、峰高、峰面积,基线在操作条件下，当色谱柱后没有组分流出时的流出曲线。反应仪器的噪音随时间的变化。,27,峰宽(W)、半峰宽(W1/2),28,29,基本理论,分离度（R）柱效率（column efficiency，N）：色谱分离的效率。理论塔板数,30,药物代谢动力学（pharmacokinetics，PK）,药物研究、开发、临床应用,研究对象,人体：I期临床，临床药物监测；生物利用度&生物等效性动物：指导临床用药、阐明作用原理、毒理机制,31,药
7、物动力学研究流程图,确定模型拟合参数,取样测定,给药,t1/2CLSTmax CmaxAUC,32,给药与取样,33,其他样品,34,生物样品的贮存,20，4080。加入酶抑制剂或抗氧化剂,体外代谢系统,肝微粒体细胞色素P450,35,预处理,预处理：除去杂质，富集样品1.进样的样品应是均相溶液，溶剂强度流动相起始强度2.避免待测组分损失。回收率不小于90%。3.不要带进新的干扰物质。4.溶剂要尽量无毒、无害或低毒、低害。,生物样品预处理 定性定量分析,36,预处理方法物理方法：萃取；离心和过滤；溶解：增溶 浓缩：冻干、蒸发、透析、减压浓缩超 滤等化学方法：衍生。扩大预分离组分之间的差异；在待
8、测组分中引入发色基团，利用紫外或荧光检测，提高灵敏度,37,前处理,（一）除蛋白 三氯乙酸沉淀或加入有机溶剂（二）组织样品的消化 与组织结合很牢的药物（三）缀合物的水解,38,一些物质的预处理,氨基酸：蛋白质沉淀、提取法、超滤法肽和蛋白质：4以下快速进行，抑制酶活性，减少降解甾体激素：水解多糖：常用有机溶剂沉淀核酸：溶与水，不溶于有机溶剂,39,校正因子,各待测物均以标准物作为基准来计算单位面积所对应的物质量（重量或体积）。,40,建立标准曲线,标准曲线：峰面积为纵坐标，浓度为横坐标；至少含5个浓度，r0.99；样品浓度不能外推,最低检测限LOD最低定量限LOQ(35个T1/2或Cmax的1/
9、10 1/20）,回收率recovery标准曲线的高中低三个浓度，每一浓度重复5次85%115%,日内差和日间差(RSD)标准曲线的高中低三个浓度，每一浓度重复5次g级：RSD10%；ng/g级接近LOQ处的RSD20%。,色谱图空白样本空白样品用药后,稳定性,41,定性、定量分析,定量分析方法：1.定量进样法（不多用）2.外标法：已知浓度的标准样；同样体积的分析样3.归一化法:仅要求测出各组分的相对含量（计算各杂质峰面积及总和，并求出占总峰面积的百分率）有不出峰物质或重叠峰存在时不能用。4.内标法：一定量纯物质作为内标物加入样品。样品中不含此组分；既能和样品互溶，又能在色谱图上分开色谱峰位置
10、处于各预测定组分的中间,定性分析方法：选定的色谱条件下，比较净保留时间或K值,内标物要求,42,数据处理系统,积分仪,色谱工作站,43,谱图,44,显示设置,45,报告编辑,46,47,48,发展,液质联用 LC-MS串联质谱 LC-MS/MS微透析技术（MD）毛细管电泳高通量药代动力学,49,借鉴书目,分析化学孙毓庆主编，人卫出版社生物药物分析（第二版）曾经泽主编，北医&协和医药高效液相色谱技术李发美主编，人卫出版社药物分析方法与应用马广慈主编，科学出版社高效液相色谱在医药研究中的应用张任斌，徐修容主编，上海科学技术出版社,50,研究蛋白组学的方法,研究蛋白质组学很重要的两个技术：双向电泳，
11、质谱。HPLC及毛细管电泳：分离上百个蛋白 双向电泳：分离上千种,51,质谱,做蛋白质鉴定较好的方法是质谱。质谱有很多类型，在生物学中主要用两种，一种是moditof，一种是积方诱导（处理量较大）。蛋白质酶解成短肽之后，分离的时候就根据分子量大小来分，每个小肽的分子量知道之后，就可以到数据库去搜索。电喷雾质谱，能知道肽段的分子量，而且把每个肽段的序列也测定出来，可靠性更大。,52,质谱过程,撞击得到高速电子 气态分子阳离子 顺序谱图 质量分析器定性结构 定量分析,导入,按质荷比m/e,峰强度,峰位置,53,Thank You!,54,应用,生化方面,医药方面,1、蛋白质分析2、肽类的分析3、核酸4、氨基酸,1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等3、药代动力学,55,
