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1、第十七章 酶在医学方面的应用,一、药用酶 二、诊断用酶,酶工程在医学方面的任务,在医学方面，酶工程是研究和解决酶在医学上应用时的各种技术问题。现代分子生物学认为生物活动的正常进行都依赖于机体内部生化反应的平衡和稳定，这种复杂而有序的生化反应需要酶来催化调节，以控制体内代谢的正常进行。因此，一旦疾病发生，究其根本原因都与酶有直接或间接的关系。,酶功能与疾病的关系,机体内部发生的疾病，往往由于酶的功能失调，把酶作为药物，补充酶的不足，或调整酶的作用，可以达到治疗的目的。例如体内某一器官失调，使酶的分泌不足，或因基因突变使酶分子结构改变，使酶丧失原有功能，都可以用酶来作补充治疗。体内许多有害物质的积
2、累，可用酶来清除。癌细胞的异常生化环境，可用酶来破坏。,帕金森综合症的病理及治疗,帕金森综合症病人的基底神经节中缺乏多巴胺，如果直接补充多巴胺，因其不能通过血脑屏障而不能产生作用。左旋多巴可穿过血脑屏障进入中枢，作为多巴胺的直接前体，在大脑中脱羧变成多巴胺。可是，左旋多巴在大脑外就会遇到脱羧酶而迅速脱羧，这就导致左旋多巴的大量浪费和不良反应的频繁发生。因此，抑制左旋多巴在脑外的脱羧是很有益的。通过同时服用左旋多巴和脑外脱羧酶抑制剂可达到此目的。,帕金森综合症治疗药物美多芭,羟苄丝肼就是脑外脱羧酶的抑制剂，将左旋多巴和羟苄丝肼以4:1配合成的药物就是美多芭。帕金森综合症病人服用美多芭与服用大剂量
3、的左旋多巴疗效一样，且耐受,性要好得多。长期服用美多芭后，帕金森综合症的症状均有显著好转。,抗菌素,临床上许多细菌产生-内酰胺酶，此酶可使阿莫西林（羟氨苄青霉素）失去抗菌活性。克拉维酸钾是不可逆的广谱-内酰胺酶抑制剂，可有效地抑制耐药菌产生的-内酰胺酶。将阿莫西林和克拉维酸钾配合在一起的药名为博美欣，它可使阿莫西林免遭-内酰胺酶的破坏，从而使原本对阿莫西林耐药的细菌变为对阿莫西林敏感。,羟氨苄青霉素,芬布芬 Fenbufen,为一较新型的长效非甾体消炎镇痛药。本品的消炎、镇痛作用虽较吲哚美辛低，但比阿司匹林强。毒性比吲哚美辛小，胃肠道副作用小于阿司匹林及其他非甾体消炎镇痛药。药理研究表明，本品
4、在体内代谢成联苯乙酯，可抑制环氧酶的活性，使前列腺素的合成减少，从而阻断炎症介质的作用，认为这是本品消炎作用的主要机制。芬布芬作为联苯乙酯的前体物，口服后可避免直接服用活性代谢物对胃肠道的刺激。,对药用酶的要求,早期酶在医疗上的应用限于帮助食物消化，问题较少；但进一步使用酶就遇到了不少问题。外来酶作为异源大分子物质，容易引起过敏反应；酶在体内半衰期很短，一般只有几分钟，不能达到治疗目的；酶进入体内后必须使之集中到治疗部位，以达到最高疗效。,酶在体外的作用,酶除了用作治疗外，还可用于医学工程的某些组成部分，使之发挥医疗作用。如利用体外循环装置清除血液中的某些废物时，酶就能发挥重要作用。将酶用作临
5、床体外检测的试剂也是近年来在医疗方面的一个重要贡献。,一、药用酶,用酶来治疗疾病最早是以淀粉酶为代表的各类口服消化用酶。1952年，Innerfield将结晶胰蛋白酶静脉注射治疗脉管炎获得成功。现在已经知道有药用价值的酶有近百种，但其中临床疗效肯定，使用安全的品种不过30余种，随着酶的稳定性、副作用、给药方式及剂型的逐步改进，酶用于医疗的情况会越来越多。,1药用酶的分类,a.消化酶类：胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、胰脂肪酶、凝乳酶、乳糖酶b.抗炎及清疮用酶：溶菌酶、超氧化物歧化酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链激酶、胶原酶、胰蛋白酶、尿酸酶、尿素酶、糜蛋白酶 c.溶纤酶类：溶栓酶、尿激酶、链激酶、蚯蚓溶
6、纤酶,尿激酶,尿激酶（urokinase，UK）是一种具有溶解血栓功能的碱性蛋白酶，属丝氨酸蛋白酶。尿激酶由肾细胞合成，从尿液中分离而得，人尿中平均含量为56 IU/ml。尿液中天然存在的尿激酶相对分子量为54000，称为高分子量尿激酶（H-UK）；经过尿液中尿蛋白酶（uropepsin）的作用，去除部分氨基酸残基，可以生成相对分子量33000的低分子量尿激酶（L-UK）。H-UK的溶血栓能力比L-UK强。,尿激酶的药用机理,UK可以激活纤溶酶原成为有溶解血纤维蛋白活性的溶纤酶，而溶纤酶能够催化血纤维蛋白、血纤维蛋白原、凝血因子、等蛋白质或多肽水解，所以UK具有溶解血栓和抗凝血的功效。UK在临
7、床上用于治疗各种血栓性疾病，如心肌梗塞、脑血栓、肺血栓、四肢动脉血栓、视网膜血管闭塞症、风湿性关节炎等。,尿激酶对纤溶酶原的激活,尿激酶的给药方式,尿激酶的给药（药品名“天普洛欣”）一般采用静脉注射或者局部注射的方式。在治疗急性心肌梗死时，也可以采用冠状动脉灌注的方式。由于尿激酶能使多种凝血蛋白水解，专一性较低，使用时要控制好剂量，以免引起全身纤溶性出血。,尿激酶的来源和降解,尿激酶又称尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plasminogen activator，uPA），它可以从人尿中提取，也可以从肾上皮细胞培养液中提取，经纯化后得到具有直接激活纤溶酶原能力的双链尿激酶，体内半衰期
8、15min，约一半被肾脏清除，其余由肝脏摄取分解。临床上已普遍使用，并且疗效确切。,组织型纤溶酶原激活剂,还有一种纤溶酶原激活剂叫做组织型纤溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activaor，tPA），它是一种存在于血管内皮细胞及其它组织的精氨酸特异性的丝氨酸蛋白酶，与纤维蛋白有很强的亲和力。纤溶酶原激活剂吸附于血纤维凝块上，激活与纤维蛋白原结合的纤溶酶原，并能防止被纤溶酶原激活抑制物（PAI）迅速灭活。它在临床上更为常用，现已有基因工程产品。,链激酶,链激酶（streptokinase,SK）是C组溶血性链球菌产生的一种分子量47kD的蛋白质，实际上它不是一种酶，
9、它与纤溶酶原结合后形成一个等摩尔比的复合物，使纤溶酶原构象发生变化，产生活性，溶解纤维蛋白。静脉或冠脉内注射可使急性心肌梗塞面积缩小，梗塞血管重建血流。对深静脉血栓、肺栓塞、眼底血管栓塞均有疗效。但须早期用药，血栓形成不超过6小时疗效最佳。,药用酶的分类,d.凝血酶 凝血酶（thrombin）是一种催化血纤维蛋白原水解，生成不溶性的血纤维蛋白，从而促进血液凝固的蛋白酶。可以从人或者动物血液中提取分离到，也可以从蛇毒中分离得到。通常从牛血、猪血中分离生产。,凝血酶的使用,从动物血液生产的凝血酶作为局部止血药使用，主要用于创伤性出血和消化道出血等的治疗。治疗创伤性出血时，直接将凝血酶溶液或粉末喷涂
10、在创伤表面，即可起到止血作用。治疗消化道出血时，将凝血酶溶液口服或者局部灌注。蛇毒凝血酶主要用于治疗各种内出血，如咯血、胃出血、视网膜出血、鼻出血、肾出血、手术后毛细血管出血等。使用时可以采用皮下肌肉注射或者静脉注射，但是要严格控制剂量，每次12单位。,不管何种给药方式，都可能产生过敏性反应。当出现过敏性反应时，应立即停药。,药用酶的分类,e.心血管疾病用酶：激肽释放酶、弹性蛋白酶、促凝血酶原激酶、细胞色素C、辅酶Q10、辅酶A。,激肽释放酶,激肽释放酶（kallikerin）是一种催化激肽原水解，释放出激肽的丝氨酸蛋白酶。血浆中的激肽释放酶催化反应的产物是由9个氨基酸残基组成的舒缓激肽。舒缓
11、激肽具有舒张血管、增强毛细血管通透性的作用，所以激肽释放酶又称为血管舒缓素。激肽释放酶可以从猪颌下腺、猪胰脏等动物器官中提取分离到。激肽释放酶主要用于治疗高血压、动脉硬化、心绞痛、微循环障碍等疾病，还有利尿作用。,药用酶的分类,f.遗传性缺酶症治疗用酶：氨基己糖酶A、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苷酯酶、酸性麦芽糖酶、苯丙氨酸氨基裂解酶g.肿瘤治疗用酶：L-天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、羧基肽酶、L-亮氨酸脱水酶、L-精氨酸酶,L-天冬酰胺酶,L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）是第一种用于治疗癌症的酶，特别是对治疗白血病有显著疗效。L-天冬酰胺酶催化天冬酰胺水解，生成L-天冬氨酸和氨。当L-天冬酰
12、胺酶注射进入人体后，人体的正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶，可以合成天冬酰胺而使蛋白质合成不受影响。而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说，由于本身不能合成天冬酰胺，外来的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解了，因此蛋白质合成受阻，导致癌细胞死亡。,注射L-天冬酰胺酶的副作用,注射L-天冬酰胺酶时，可能出现过敏反应，偶尔还可能出现过敏性休克。但停药以后，这些副作用会消失。在注射L-天冬酰胺酶之前，应作皮下试验。在一般情况下，注射该酶可能出现的过敏性反应包括发热、恶心、呕吐、体重下降等。,2药用酶的固定化和给药方法,长期以来药用酶的剂型是将纯化的天然酶制成口服、注射、或外用等制剂为主要给药方式。但对于稳定
13、性较差，在体内半衰期很短的酶则治疗效果很差。特别是近年来发展的治疗遗传性缺酶症、代谢紊乱症、肿瘤以及心血管病等的酶，如能利用酶的固定化技术和新的给药方式，可使酶发挥较大的作用。,药用酶的固定化方式,将酶以微囊、红细胞载体、人白蛋白载体等形式，通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射等方法引入体内，可以延长酶的半衰期，且使酶缓慢释放，提高酶的功效。红细胞膜上有许多小孔，在溶血过程中小孔可以开放，使血红蛋白逸出，同时也能使其它蛋白进入胞内。如果用人工方法使红细胞膨胀，可使酶进入红细胞内。,药用酶的红细胞固定法,用酶液稀释经过清洗的红细胞，加入低渗盐水，使酶通过暂时胀大的细胞膜孔，进入细胞。然后用高渗盐水恢
14、复其等渗状态。再经多次离心洗涤除去剩余酶液。这种红细胞载体可以注入人体，能将酶活力集中于肝脏（约70），比较安全可靠。,口服药用固定化酶,包埋的含酶颗粒可以经口服使酶在胃肠道释放，并与相应的底物反应，降低胃肠道中底物的水平，从而间接降低血液中底物的水平。如口服尿素酶微囊可降低血中尿素的水平。,微型植入式注射泵,使用微型植入式注射泵，是一种长期给药的方法。它能 使药物在血中的水平保持稳定，避免药物水 平在血中波动太大；避免多次注射引起的局部感染和局部肿块的 产生；病人可以自由行走；药物可以集中于病灶局部。,微型植入式注射泵,由于注射泵植入体内，出了故障不便修复；异物植入容易引起反应，必须选择合适
15、的材料；药物与泵材料之间不能发生反应。目前使用钛合金制作泵体，硅橡胶管为泵管。其动力初期是采用蓄电池，现在有一种利用氟碳化合物的蒸气来推动泵的活塞，而蒸气的压力则借助于体温。型糖尿病人可使用微型植入式注射泵注射胰岛素（型糖尿病为非胰岛素依赖型）。,药用酶的体外应用,配合体外循环装置将酶固定在微囊、玻璃球、尼龙管、纤维素、胶原蛋白等上面，安装在透析器内，解决异体蛋白在体内引起的过敏问题。,人工肾,人工肾是体外循环装置中最成功的代表。它是利用体外循环将患者的血液通过透析器除去代谢废物（如尿素）后重新返回体内的一种装置。老式的人工肾需要体积庞大的透析液，既不经济又不方便。1968年，T.M.S.Ch
16、ang加以改进，将通过透析器的含尿素的透析液用泵输入到一个玻璃柱内。柱的一端装有尿素酶微囊，另一端装有活性碳或离子交换剂。当透析液通过玻璃柱时，其中的尿素受尿素酶作用转变为二氧化碳和氨，氨被活性碳吸附，二氧化碳回到血中由肺排出体外。,人工肾,活性碳也能除去血液中的其它废物。整个装置可以降低血液中的尿素达80。此装置的优点是体积小型化，透析液可以循环使用，使人工肾成为实用化的一种医疗器械。,药用酶在体内的分布,根据酶微囊颗粒的大小，可以使微囊集中在某一器官或组织。用人白蛋白制成的酶微囊，直径在1530m以上，静注时可通过心脏，进入肺部微血管，在此可集中99的酶。如果是直径为13m的微囊，则静注后
17、可到达网状内皮系统，在此可集中90的酶。再小于1m的颗粒则可在肝（80）、脾（58）、骨髓（12）中依比例分布。使微囊表面带上特殊物质（抗体、可识别物质）与特定组织细胞表面的抗原或受体反应，达到定向给药的目的。,二、诊断用酶,诊断用酶是用来检测体内某些与疾病有关的代谢物质或与疾病有关的酶活性变化，从而诊断病情。酶法检测有快速、简便、正确、灵敏等优点，因而发展很快。对诊断用酶的要求比药用酶低些，因其不用于体内，可以不考虑其抗原性和毒性；对纯度的要求是只要不含有能干扰所需反应的物质即可，如脱氢酶中不能含有NADH氧化酶，激酶中不能含有肌激酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中不能有6-磷酸葡萄糖酸。,酶在疾
18、病诊断方面的应用,不同来源的酶性质不同,化验所用的酶可以是来自微生物，也可以是来自动植物。不同来源的同一种酶往往反应性质不同，例如从酵母中提取的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶只能利用辅酶（NADP+）为反应时的受氢体，而从肠膜状明串珠菌来的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶则能利用辅酶（NAD+）或辅酶（NADP+）为反应时的受氢体；微生物来源的尿酸酶的最适反应pH为67，而从牛肾提取的尿酸酶最适pH为910。,1建立酶反应系统,在大多数情况下，酶法分析需要一个以上的酶和一个以上的反应，才能达到检测的目的。,胆固醇氧化酶,过氧化物酶,始发反应：,指示反应：,胆固醇 O2 胆甾酮 H2O2,H2O2 显色底物 有色
19、物质 H2O,胆固醇酶法测定,显色底物,显色底物又叫色原，对于测H2O2来说色原有两类：第一类为单一色原，常用的有邻苯二酚、邻联（二）茴香胺及2,2-连氮基-双（3-乙苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）。第二类为双色素原，即由两种色素原合成一种有色物质，如酚和4-氨基安替比林、3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone（MBTH）和二甲基苯胺。,显色底物,单一色原,双色素原,酚+,二甲基苯胺+,指示反应的选择,指示反应的产物应便于检测，常用于检测的指示反应产物是：有色物质、有紫外吸收的物质，使pH发生变化的物质。因为H2O2有上述指示反应，所以常利用可以
20、产生H2O2的始发反应。NAD(P)H在340nm处有光吸收，而NAD(P)没有，用紫外比色可以测定NAD(P)H的变化，所以产生或消耗NAD(P)H的反应也可作为指示反应。若没有适当的始发反应和指示反应可以利用，可在始发反应与指示反应之间再加一到两个中间反应。,肌酸激酶的测定,肌酸激酶,始发反应：,ADP 肌酸 ATP,己糖激酶,中间反应：,ATP 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 ADP,指示反应：,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,6-磷酸葡萄糖酸 NADH,6-磷酸葡萄糖 NAD,酶法测定甘油三酯,丙酮酸 NADH 乳酸 NAD,脂肪酶,甘油激酶,丙酮酸激酶,乳酸脱氢酶,始发反应：,甘油三酯 甘油 脂肪酸,
21、中间反应：,甘油 ATP 甘油-3-磷酸 ADP,中间反应：,ADP PEP 丙酮酸 ATP,指示反应：,2底物测定原理,（1）平衡法,式中S代表待测底物，C是辅酶或辅反应物，P和Q是反应产物。反应达到平衡时用掉的底物比例越高，测定的结果越精确。反应的平衡常数越大，辅酶或辅反应物与底物的浓度比越大，平衡时用掉的底物就越多。,平衡法是测定酶反应达到平衡时的产物生成量。该法要考虑反应的平衡常数、达到平衡点所需要的时间、所需的酶量和辅酶或辅反应物的量。设反应如下：,达到所述百分转化率所需的 C0:S0比率,提高反应程度和确定反应时间,平衡常数大时所需辅酶或辅反应物的量就少。在低Keq值时要求非常高的
22、C0:S0比率，但在实际使用时，C0太高可能会不溶解，也可能会对酶产生抑制作用。在低Keq值时可以加入某种能与产物之一反应的物质，从反应混合物中除去产物之一，而使反应进行得更为彻底。在最适反应条件下达到反应平衡所需的时间与酶量有关，酶量多则达到反应平衡所需的时间短。应采用在适当时间内达到平衡所需的酶量。,底物测定原理,（2）动力学法 20世纪60年代初以来，出现了各种连续动力学分析仪，这些仪器一般是通过若干固定的时间间隔对反应的进程进行跟踪，检验曲线的线性部分，并打印出反应的初速度，根据反应的初速度计算出底物浓度。此方法的灵敏度随着底物浓度的增加而明显降低，因此S0Km是动力学法应用的上限。,
23、3酶活性测定原理,当底物浓度远大于酶浓度时，测定反应的初速度，反应的初速度与酶活性成正比。,4干试纸条,将测定底物所需的酶和其它物质按一定次序铺在试纸（或塑料片）上，滴上待测溶液或将试纸条浸入待测溶液中，就会产生颜色变化，将产生的颜色与标准色版比较，可得到测定结果。,尿素干试纸条的结构,当一滴血清滴到尿素干试纸条上时，样品首先同多孔的扩散层接触，通过毛细作用快速均匀地扩散开来。扩散层下面是试剂层，此层含有结合在明胶上的脲酶和,缓冲剂。脲酶催化尿素水解成氨和CO2，然后氨通过半透膜扩散到指示剂层，在此产生颜色。干试纸条还可用于测定葡萄糖、尿酸、胆固醇、甘油三酯等。,5酶电极,酶电极又叫生物分析探
24、针，它是由一种电化学传感器和一层固定化酶层及一到两层滤膜组成，用来测定某些物质的含量。待测物通过滤膜扩散到固定化酶层，经酶催化转变成产物，产物再扩散到电化学传感器表面发生电化学反应，产生电信号，此电信号经放大后用电流表或电压表指示出来，或用记录仪记录下来。若用电流表示，被测物质的浓度与电流成线性关系；若用电压表示，则被测物质的浓度与电压成对数关系。,电化学传感器,电化学传感器又称为电极，不同的电极对不同的物质敏感。根据敏感物质的不同，电极分为氧电极、H2O2电极、氨电极、CO2电极、pH电极等。对底物专一性强并能产生这些敏感物质的酶与相应的电极组合，就可用来测定相应的底物。实用的酶电极要求专一
25、性强，灵敏度高，抗干扰能力强。,葡萄糖酶电极,外膜由聚碳酸酯制作。它允许葡萄糖、氧气及其它小分子物质透过，不允许细胞和大分子物质透过。,葡萄糖酶电极,外膜由聚碳酸酯制作。它允许葡萄糖、氧气及其它小分子物质透过，不允许细胞和大分子物质透过。固定的葡萄糖氧化酶催化的反应为：葡萄糖 O2 葡萄糖酸 H2O2 反应产物H2O2扩散透过醋酸纤维制成的内膜，在铂电极(阳极)处发生下列反应：H2O2 O2 2H 2e 醋酸纤维内膜的孔更小，其截留分子量为100。该膜可以阻止葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、以及大部分其它可能产生干扰的物质到达电极。,葡萄糖氧化酶,青霉素酶电极,青霉素酶电极以固定化青霉素酰化酶的酶膜与
26、pH电极结合而成。将青霉素酰化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶或光交联树脂膜内，然后紧贴在玻璃（pH）电极上即成。当青霉素酶电极浸入含有青霉素的溶液中时，青霉素酰化酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，使得溶液中氢离子浓度增加，通过pH电极测出pH变化而测出样品溶液中青霉素的浓度。,酶电极的优点,酶电极用于临床检验有许多优点：检测快速、灵敏度高、取样量少、费用低、携带方便。使用时主要应注意干扰物质的影响。各种酶电极的组成及其测定对象,6酶法免疫测定（EIA）,利用抗原抗体反应的专一性，可以进行一些物质的测定，被测定的物质既可以是抗原，也可以是抗体。酶法免疫测定可分为均相反应和非均相反应两类。,（1）均相反应,均
27、相反应在检测时不需要分离抗原、抗体或抗原抗体复合物，方法简便、快捷。,酶标抗原,用一定量的酶标抗原和未知量的游离抗原（待测抗原）竞争性地与有限量的抗体反应，然后又分为两种情况：一是酶标抗原上的酶有活性，与抗体形成酶抗原抗体复合物后酶失去活性。二是酶标抗原上的酶失去活性，与抗体形成酶抗原抗体复合物后酶恢复活性。第二种情况的例子如甲状腺素苹果酸脱氢酶结合物中的酶没有活性，与甲状腺素的抗体结合后酶恢复活性。,底物标记抗原,用底物标记抗原，与待测抗原及抗体反应后，加入游离酶，游离的底物标记抗原具有底物活性，可被酶催化形成产物，而与抗体形成底物抗原抗体复合物的不具有底物活性。产物的量与待测抗原的量成正相
28、关。这种方法因没有放大作用，灵敏度较差，但若能产生荧光产物可补偿这个缺点。如伞形酮艮他霉素可被半乳糖苷酶水解产生荧光产物。,酶抑制剂标记抗原,用酶抑制剂标记抗原，如甲状腺素在同磷酸盐共价结合后，就可成为胆碱酯酶的不可逆抑制剂，但磷酸化的甲状腺素在与甲状腺素的抗体结合后，就不能抑制胆碱酯酶。当体系中含有一定量的游离酶时，剩余的酶活性与待测抗原成反相关。待测抗原往往是混合物(如血清)，若其中含有酶活性抑制剂，会影响测定结果。,（2）非均相反应,非均相反应常被称为Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay（ELISA），此法需要用到固相载体，首先要将抗原或抗体固定到固相载体
29、上。常用的固相载体是聚苯乙烯微孔板(酶标板)，还有用聚乙烯、聚丙烯等材料制成的微孔板。,ELISA设备,酶标仪,全自动酶标仪,全自动洗板机,酶标板,测抗体,将纯化的抗原固定到微孔板的孔中，加入不同稀释度的抗血清，待测抗体即和固定的抗原结合，洗涤后，加入酶标的二抗（抗抗体），再洗去未结合的多余酶标二抗，加底物显色、比色，色度与抗体的量成正相关。,非均相反应测抗体,酶标抗抗体,待测抗体,固定抗原,测抗原,a.双抗夹心法：将抗体固定到微孔板的孔中，加入待测抗原，待测抗原与固定的抗体结合，再加入酶标抗体，酶标抗体与待测抗原结合，洗去未结合的多余酶标抗体，加底物显色，比色，色度与待测抗原的量成正相关。若
30、上述酶标抗体换成非酶标抗体（必须与固定抗体不同，如分别为鼠和兔来源），洗涤后再加上酶标二抗，可提高检测的灵敏度。此法只适合于测定具有两个以上抗原决定簇的抗原。,双抗夹心法测抗原,酶标抗体,固定抗体,待测抗原,固定抗体（兔）,一抗（鼠）,酶标二抗（羊抗鼠）,测抗原,b.竞争法：将抗体固定到微孔板的孔中，再加入待测抗原和一定量的酶标抗原，两种抗原竞争与固定抗体结合，待测抗原多则结合上去的酶标抗原少，色度与待测抗原量成反相关。竞争法适合于测定只具有一个抗原决定簇的抗原。,测抗原,c.竞争法：让游离的待测抗原和抗体在试管中反应，然后加到固定有纯化抗原的微孔板的孔中，待测抗原多则结合到固定抗原上的抗体少
31、，洗涤后加入酶标二抗。色度与待测抗原成反相关。在非均相反应中，因有多次洗涤过程，待测抗原中若有酶的可逆抑制剂，影响不大。,（3）标记酶的选择,采用标记酶有放大作用，因为每一个酶分子可以催化许多底物转化成产物。理想的标记酶要有下列特点：a.在抗原抗体结合的最适pH条件下，酶有高的比活性；b.酶有一些可供共价偶联的反应基团，与抗原或抗体偶联后酶活性损失很小；,标记酶的选择,c.酶活性不受测定液中各种因素的影响，抑制剂标记抗原的影响除外；d.酶反应的产物为有色物质，颜色稳定，便于比色检测；e.价廉（包括酶、底物）；f.底物、酶、产物对人无害。,常用的标记酶,常用的标记酶有过氧化物酶，它价格便宜，是糖蛋白，可以用高碘酸活化法与抗原或抗体偶联。防腐剂、氧化剂、还原剂会使该酶失活，所以反应体系中不能含有这些物质。用比色法可以测出皮摩尔水平的酶，最灵敏的底物是邻苯二胺（同时加H2O2），但其具有光敏性，应在弱光下使用。另一种常用的标记酶是碱性磷酸酶。,
