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1、HIV检测技术,艾滋病实验诊断技术,HIV抗体测定 抗原测定 核酸测定 病毒分离 CD4淋巴细胞计数,急性期,潜伏期,窗口期,HIV感染以后的血清学动态,Anti-P24,Anti-gp41/120(anti-gp36),HIV RNA,Anti-Ag,感染 1周 2周 3周 4周.1年 2年 3年.10年.,艾滋病期,Anti-Ab,浓度,HIV抗体检测的目的和要点,HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。,以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。以
2、监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。,初筛实验室设备条件,独立实验室用房，建筑设备和仪器要符合要求II级生物安全实验室酶标仪，洗板机，精确移夜管，专用冰箱，离心机，水浴箱，温箱等消毒和污染处理设施安全防护设施,艾滋病检测方法的意义,HIV抗体筛查检测 HIV/AIDS的筛查，但初筛阳性结果不能做为艾滋病诊断依据，需将该标本送确证实验室进行确证。HIV抗体确认检测（免疫印迹试验）-HIV/AIDS诊断的唯一依据-艾滋病确认实验室负责HIV核酸检测辅助诊断：在特殊情况下，如出现某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供有
3、用的证据。感染早期：在HIV感染的窗口期，无法使用抗体检测进行诊断，此时RNA的测定具有特殊的意义，提示是否有感染的可能，但仍需追踪检测HIV抗体，最终根据抗体的检测情况做出诊断。病程监控：帮助确定疾病发展的阶段。指导治疗方案及疗效测定。预测疾病进程。,抗体检测,根据检测HIV感染后产生的HIV抗体的间接指标而 发展起来的血清学诊断技术，分为初筛试验和确认试 验。初筛试验 用于对检测对象感染情况的初步筛查，检测结果可能会有假阳性，不能发抗体阳性报告确认试验 确定检测对象是否有HIV抗体，可发抗体阳性报告,酶联免疫试验(ELISA),最早用于检测血清中HIV抗体的有效筛检方法很高的敏感性和特异性
4、根据检测方法，可分成4类间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法 HIV抗体检测试剂根据其抗原的来源和检测方式可分为四代,筛查试验,筛查试剂经国家食品药品监督管理局注册批准在试剂有效期内酶联免疫试剂应批批检合格临床质量评估敏感性和特异性高,第一代ELISA试剂,包被抗原：全病毒裂解抗原窗口期：6-8星期优点：灵敏度高，可检出各种抗体缺点：制备麻烦，成本高，假阳性1985年，FDA批准第一个HIV抗体筛选试剂,第二代ELISA试剂,包被抗原：重组抗原、合成多肽 窗口期：4-5星期优点：重组抗原可消除HLA（人类白细胞抗原）所致的抗体假阳性，生产成本低，不使用HIV病毒颗粒，较为安全，敏感性特异性较高
5、缺点：仍有一定的假阳性1990年，FDA批准第一个重组抗原筛选试剂,第三代ELISA试剂,包被抗原：重组抗原加合成多肽合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高窗口期：3星期左右优点：可检测所有不同种类的抗体，增加了试剂的敏感性和特异性1994年发展了双抗原夹心法，酶标物由抗人IgG改变为特异性HIV抗原,第四代ELISA试剂,包被物：重组或多肽抗原+重组抗体窗口期：2星期左右优点：同时检测HIV抗原抗体，缩短窗 口期注意：抗原检测敏感性低于单独抗原试 剂(5070pg/ml,510pg/ml)1998年第四代试剂首次上市,HIV抗体试
6、剂盒进展,代次抗原方法检测时间1全病毒间接 2个月2 重组或多肽 间接3-4 周3 重组+多肽夹心2-3 周4抗原+抗体夹心2周左右,Closing the window,第一/二代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG、IgM抗体,第四代试剂同时检测IgG、IgM抗体和P24抗原使窗口期缩短。,筛查样品,HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。,唾液检测试剂,在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可以同时检测HIV1/HIV2抗体，原理为酶免间接法。ELISA、免疫印迹法（WB）已经美国FDA批准,优点:1.样品稳定,各种温度下稳定性大于三周 2
7、.敏感性和特异性与标准的血清学实验相当缺点:1.预处理复杂，重复性较差 2.会出现不同于血清抗体的种类和滴度,尿液检测试剂,适用对象：静脉吸毒人群，其他高危人群的 大 面积流调、监测 优点：1.采集、处理费用低，较血液标本安全 2.HIV抗体在尿中十分稳定，尿液中IgG与血液相当 缺点：1.检测时间长 2.精确性低于血、唾液，阳性者需作血清学检测,筛查方法,酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验快速检测（RT）明胶颗粒凝集试验（PA）免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 免疫层析试验,酶联,酶联免疫吸附ELISA方法 间接法 夹心法双抗原和双抗体 竞争
8、法 捕获法,间 接 ELISA 方 法 Ag+Ab+Ab-E,酶标记抗人IgG,标本中的HIV 抗体,底物,酶,产生颜色,HIV抗原,固体载体,双 抗 原 夹 心 法 Ag+Ab+Ag-E,标本中HIV抗体,HIV抗原,酶标的HIV抗原,双 抗 原 夹 心 法 Ag+Ab+Ag-E,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。HIV第三代试剂都是运用此法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,竟 争 ELISA 法 Ag+Ab+Ab-E,病人血清,底物,无色或很微量反应,酶标抗体,HIV抗原,产生颜色
9、,抗原捕获法 将抗HIV-McAb包被固相板中 加入HIV特异性Ag 待检血清标本 酶标Ab/(E标抗人IgG)底物显色,抗体捕获法（特异抗体捕获）抗人IgG 包被固相载体 待检血清标本（总IgG）E标记HIV 底 物 特点：提高敏感性特异性,试剂的平衡,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。,加样及试剂,加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的下1/3处，避免加在
10、孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，否则会导致加样不均匀或污染，加样保持匀速：太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。每次加样应更换吸头，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。,样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样,温度和时间,温育温度：ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，
11、要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度为37。温育时间：孔内温度从室温升至37，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长。注意弱阳性标本。,边缘效应的排除：即外周孔显色较中心孔深。研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种是放在水浴箱的隔板上，使板条与水直接接触，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3 处，不可将板条叠加放置。排除边缘效应可以提高实验的稳定性
12、。,洗涤,ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。艾滋病检测要求使用洗板机：减少操作者人为误差、保护操作者、降低板孔残液量。,以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。,但由于抗体或抗原的包被通
13、常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。,显色,一般商品试剂盒显色反应条件为37。从理论上说，372530分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。但为使弱阳性样本孔能有充分的显色，应在37下反应30分钟后终止反应。一般底物经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,此外，在加入底物前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔
14、或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。,比色,ELISA的比色测定由酶标仪进行 显色反应终止后应在30分钟内完成比色双波长比色：校正波长均用630nm。在敏感波长（450nm）和非敏感波长（630nm）下各测定一次。建议尽量使用双波长比色调零而不用空白对照调零.,读数,使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用吸水纸擦干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。,酶联实验的影响因素,标本的采集和保存一般使用血清（浆）。标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰结果，可造成假阳性；长菌的标本会因细
15、菌分泌一些酶，干扰酶联反应；抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。,标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冰冻保存融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡尽量避免反复冻融，反复冻融过程中产生的机械剪切力将对样本中的蛋白等分子产生破坏作用,ELISA的灵敏度1ng/ml水平上,因此要尽量避免标本间的污染。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。,ELISA试验中可能出现的问题及原因分析,化学发光或免疫荧光试验,这类试剂采用发光或荧
16、光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。原理：HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,快速检测（RT）及其它检测试验,这类试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在1030分钟内得出结果。,明胶颗粒凝集试验（PA）：原理：将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和
17、阳性质控。,凝集实验,常用的载体：红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、明胶颗粒、活性碳或硅胶铝颗粒,前滞现象：反应中抗体含量过多，影响抗原抗体的理想结合，大量抗体结合于抗原阻碍了交叉联结符合体的形成，使肉眼观察不到凝集现象，造成假阴性。解决办法：稀释样品,凝集试验注意事项,试验应设对照，特别是未包被抗原的载体对照，以防止非特异载体凝集反应的干扰乳胶试剂对于冻融过的血清假阳性率高，对于新鲜血清没有这种现象。乳胶试剂切忌冻结，冻结后易发生自凝结果判读要及时，避免假阳性,HIV抗体检测（明胶颗粒凝集试验）,材料 血清标本,U型板,PA试剂盒(“A”溶解用液,”B”血清稀释液,”C”致敏颗粒,”D”非致敏颗粒,
18、阳性对照血清,专用滴管.方法(1)从4冰箱取出试剂盒,恢复至室温后使用.(2)从1:4开始做倍比稀释.(3)用专用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏颗粒”D”,第三孔加1滴(25ul)致敏颗粒”C”.(4)轻轻拍打微量板或在振荡器上振荡1分钟混合后,室温(20)静置2小时后观察结果.,HIV抗体检测（明胶颗粒凝集试验）,结果判断 明胶颗粒沉积在孔底,周边平滑,或形成致密圆圈者为阴性结果.(-)明胶颗粒沉积在孔底,中央形成致密小环,周边平滑为可疑反应.(+_)孔内有清晰的宽环且外缘粗糙者,为阳性结果.(+/+)孔内凝聚颗粒形成均一的膜覆盖在整个孔底者为强阳性反应.(+/+)孔内样品与致敏和非致
19、敏颗粒均产生凝集者,则需作重吸收试验后进一步检测.,免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验原理：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。,免疫层析试验原理：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。,ELISA试剂（13种）丽珠、生物梅里埃、万泰、MUREX、绿科、永华、金豪、科华、新创、普生、中山、华美、吉比爱快速试剂（7种）科华、新创、PA、雅培、EY
20、、艾康、万泰,抗体初筛试验的局限性,阳性结果不能确认，需用其他试剂复查阴性结果不能排除HIV感染：在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结购，出现凝集抑制。不能诊断18月龄婴儿的母婴垂直感染新出现的亚群难以检测,HIV抗体初筛检测结果解释,如何判断婴儿是否感染了HIV？感染了HIV的母亲所生的婴儿可能通过胎盘带有来自母体的HIV的IgG抗体，此时HIV抗体检测阳性并不意味着已被感染。建议在婴儿9个月时进行HIV初筛检测 如阴性，则判定为未感染HIV。如阳性，则应在婴儿18个月时进行复检 阴性：判定
21、为未感染。阳性：则将血样送至确证实验室进行HIV抗体的确认试验。,确认试验的试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法 包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEK HIV）、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）。国内常用的确认试验方法是WB。,HIV抗体确认试验,确认检测流程 先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性；如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确认试
22、验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应则报告HIV-2抗体血清学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析。,艾滋病实验室诊断确认试验(蛋白印迹Western-Blot),原理 病毒裂解物抗原经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,然后将分离后的抗原转移(印迹)到硝酸纤维薄膜上,采用类似ELISA的技术,当样品中含有HIV抗体时,它和印迹在硝酸纤维薄膜上的病毒抗原相结合呈现肉眼可见的特异性带型.HIV-1抗体特异带包括：env带 gp160/gp120、gp41；gag带 p55、p24、p17（或p18）；pol带 p66（或p65）、p51、p31。HIV-2抗体特异条
23、带包括：env带 gp140/gp105、gp36；gag带 p56、p26、p16；pol带 p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env带也可为gp125/gp80、gp36）。,WB原理,确认试验结果的判定下面是我国使用WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则。在实际工作中还应参照所用试剂盒说明书综合判定，遇疑难情况应报上级实验室解决。&HIV-1抗体阳性（+）至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条env带和p24带同时出现。&HIV-2抗体阳性（+）同时符合以下2条标准可判为HIV-2抗体血清学阳性：（1）符合WHO阳性判定标
24、准，即出现至少2条env带（gp36和gp140/gp105）。（2）符合试剂盒提供的阳性判定标准。&HIV抗体阴性（-）无HIV抗体特异带出现。&HIV抗体不确定（）出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。,HIV抗体WB实验的阳性判断标准,1,3,2,4,GP160,GP120,P66,P55,P51,GP41,P31,P24,P17,血清对照,P39,HIV-2特异带,WB结果解释,HIV不确定结果的分析,HIV抗体不确定结果的原因 1.HIV早期感染，此时可能仅出现一条env带 或 p24、p31、p55带 2.非特异反应，如高丙球蛋白血症、某些病毒性疾病和寄生虫感染、自身免疫性疾病等可引起该现象 3.少数晚期艾滋病患者 4.与HIV裂解物中的宿主细胞成分发生交叉 反应 5.O亚型毒株 解决办法：随访,窗口期,定义 从HIV感染到HIV抗体被检出的时间,一般为六周到十二周,窗口期的决定因素,初筛试剂质量和测试技术机体免疫反应病毒特性-窗口期无法避免,谢谢大家,
