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1、TMA的原理及应用,中国医学科学院输血研究所刘鱼,人员培训,方法原理核酸扩增检测的关键环节仪器设备的使用、维护和校准结果的分析、报告及进一步处理质控的分析知其然又知其所以然,优点：检测病毒专一性强，不会出现假阳性 缺点：敏感性差、操作时间长、操作复杂，必须在特定的P3实验室中才能进行，且费用较高，有些病毒还没找到合适的培养体系,病毒,Anti-HIV-1/2Anti-HCVHIV-1 p24HBsAg,核酸检测（NAT）,优点：操作简便，成本低缺点：漏检原因：窗口期 病毒变异 免疫沉寂,HIV-1HCVHBV,血清学检测,病毒分离培养,病毒感染的检测方法,血清学检测和核酸检测的窗口期比较,窗口
2、期：从感染病毒开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的 这一段时间 病毒（核酸）抗原抗体,10,20,30,40,50,60,70,80,90,0,Viral RNA,Ag or AbLevel,HIV-1RNA,Ab to HIV-1,10,20,30,40,50,60,70,80,90,0,Days post infection,Viral RNAor AbLevel,HCV RNA,Ab to HCV,p24 Ag,5,检测窗口期Window Period,6,全球血液NAT检测应用情况,Country,Technology,Pool/IDT,Germany德国(1997年起部
3、分,1999年月起，全部）Netherlands荷兰(1997年起）U.K.英国(2000年起）Switzerland瑞士Japan日本(1997年月起对原料浆；1999年初起献血者）Canada加拿大USA美国(1999年3月起）New Zealand新西兰Australia澳大利亚Singapore新加坡Portugal葡萄牙France法国(2000年起）Spain西班牙Italy意大利Hong Kong香港台湾（准备中）韩国（2005年1月起）,PCRPCRPCRPCRPCRPCRTMA/PCRTMATMATMATMA TMA/PCRTMA/PCRTMA/PCRTMATMA/PCRTM
4、A/PCR,PoolPoolPoolPoolPoolpoolpool/IDTIDTpool/IDTIDTIDTPool/IDTPoolPoolpoolPoolPool,7,美国NAT检测结果(NAT yield in USA),人份或人份混合 1999.03-2002.03：,-Susan et al,N Eng J Med 2004,351:760-768,8,澳大利亚NAT检测结果(NAT yield in Australia),5 个NAT检测点，2个单人份检测，3个24人份检测 TMA 2000年6月7日-2004年11月14日,9,中欧NAT检测结果(NAT yield in Cen
5、tral Europe),Roth WK,Weber M,Buhr S,et al.Yield of HCV and HIV-1 NAT after screening of 3.6 million blood donation in central Europe.Transfusion,2002,42:862-868.,人份混合HCV PCR:Cobas Amplicon,RocheHIV PCR:an in-house PCR,10,日本NAT检测 结果（NAT yield in Japan）,(2000.2.1 2002.12.31),J Virol Methods.2003;112:1
6、45-151,-Multiplex HBV/HCV/HIV-1 reagent-50人份,11,法国NAT检测 结果（NAT yield in France）,(2001.7 2003.12),-Euro Surveill.2005 Feb 1;10(2)Epub ahead of print,-TMA-8或16人份,12,新加坡NAT检测结果（NAT yield in Singapore）,1个NAT检测点，单人份检测 TMA 2000年10月-2004年10月,13,韩国NAT检测结果(NAT yield in Korea）,2004年6月14-12月3日，前期评估 单采献浆者：24599
7、 献血者：15597 TMA HCV NAT阳性：1/40196；HIV NAT阳性：1/40196 2005年1月1日起，全面开展,R.N.Makroo,N.Choudhury*,et al.Indian J Med Res 127,February 2008,pp 140-147Hua Shan，Fu-rong Ren，Jing-xing Wang，et al.Transfusion.2007;47:2011-2016,Calculated Risk/1,000,000 RBC Units Transfused in U.S.,M.Busch,2001,数据总结,NAT检测的必要性：大大降
8、低输血传播传染病的风险检测技术：荧光定量PCR技术/TMA检测模式：MP/IDT我国国情,核酸检测基本原理,核酸检测：一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，对靶核酸直接扩增或对其附带的信号扩增，使看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号。DNA：A T C G RNA：A U C G杂交或扩增：C A A G T U,PCR：聚合酶链式反应；LAMP：环介导等温扩增技术；LCR：连接酶链式反应；SDA：链替代扩增；NASBA：依赖核酸序列的扩增；TMA：转录介导的扩增技术；bDNA：多分枝DNA 杂交信号放大技术;Invader：侵染检测技术;,核酸提取,靶核酸的直接扩增,信号放大扩增,检
9、测,检测,LAMP,PCR,LCR,SDA,NASBA,TMA,bDNA,杂交捕获,Invader,基因信息流动方向,DNA,DNA,复制,RNA,转录,蛋白质,翻译,逆转录,PCR,TMA,PCR 原理,DNA,DNA,复制,TMA技术的发展历史,TAS(Transcription-based amplification system,转录依赖的扩增系统)1989，Kwoh,TMA的原理,Transcription-Mediated Amplification 转录介导的扩增技术模拟DNA 转录成 mRNA 的自然过程DNA模板在反应中作为中介利用2个引物和2种酶(RNA聚合酶和逆转录酶）R
10、NA聚合酶与 DNA 模板的启动子序列结合等温扩增（41.5）,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,TMA的反应体系,两种酶：MMLV逆转录酶，T7 RNA聚合酶两条引物：引物A（带T7RNA启动子），引物BdNTP,NTP,TMA的原理,T7启动子,非循环相,循环相,逆转录,TMA技术和NASBA技术比较,TMAMMLV(Money鼠白血病病毒逆转录酶):逆转录,RNase HT7RNA聚合酶温度：41.5,NASBAAMVRT（鸟类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶）RNase HT7RNA聚合酶温度：41,TMA的应用,1.临床检测检测尿液，阴道分泌物及血液中的沙眼衣原体和奈瑟氏淋球菌
11、 结核分枝杆菌 HIV-1 和HCV2.血液筛查HIV-1/HCV 二联检测HIV-1/HBV/HCV三联检测WNV(西尼罗河病毒),标本,应用举例：检测流程,HIV-1/HBV/HCV三联检测,阳性,阴性,dHIV-1 分析,dHBV分析,dHCV分析,Procleix Ultrio Assay,三个主要步骤:,Step 1,核酸提取(Target Capture,TC),Step 2,核酸直接扩增（TMA）,Step 3,检测：HPA DKA,HIV-1,HCV,与捕获探针杂交,磁珠,与磁珠黏附,释放RNA/DNA,AddIC RNA,Procleix Ultrio Assay Step
12、1:Specific Target Capture,溶解病毒包膜、蛋白质，释放病毒基因组RNA/DNA；与捕获探针杂交，黏附于磁珠不需要单独的提取，纯化和浓缩,M1013.0,HBV,Procleix Ultrio Assay Step 1:Target Capture Wash,去除血浆成分和非特异性的DNA/RNA,保留待扩增的DNA/RNA,Procleix Ultrio Assay Step 2:Transcription-Mediated Amplification,IC,HIV-1,HBV,HCV,Procleix Ultrio Assay Step 3:Chemiluminesc
13、ent Detection,HIV-1,HCV,IC,glow,glow,flash,Add detectionreagents,HybridizeAE labelprobes,Hydrolyze AEunhybridizedprobes,RNA扩增子,HBV,检测发光,杂交保护,双动力学检测,glow,Procleix Ultrio Assay Step 3:Detection Dual Kinetic Assay(DKA),0,2,000,4,000,6,000,8,000,10,000,12,000,0,0.5,1,1.5,2,Relativelightunit,Time(seconds
14、),Procleix HBV Discriminatory AssayStep 3:Chemiluminescent Detection,HIV-1,HCV,IC,Measurelightemission,flash,HBV,glow,Add detectionreagents,HybridizeAE labelprobes,Hydrolyze AEunhybridizedprobes,RNA扩增子,Procleix HIV-1 Discriminatory AssayStep 3:Chemiluminescent Detection,HIV-1,HCV,IC,Measurelightemis
15、sion,glow,flash,HBV,Add detectionreagents,HybridizeAE labelprobes,Hydrolyze AEunhybridizedprobes,RNA扩增子,Procleix HCV Discriminatory AssayStep 3:Chemiluminescent Detection,HIV-1,HCV,IC,HBV,Add detectionreagents,HybridizeAE labelprobes,Hydrolyze AEunhybridizedprobes,RNA扩增子,TMA与PCR比较,TMA的优点 缺点,易于自动化,灵敏度高,扩增效率高：10n,不能绝对定量,Azzedine Assal,Valrie Barlet,et al.Transfusion.2009;49:289-300.,谢谢！,
