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1、蜡样芽胞杆菌检测Bacillus cereus examination,浙江省疾病预防控制中心梅玲玲,蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),芽胞杆菌属（Bacillus）在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多食品中常见 已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、酱油、布丁、米饭及各种甜点。1950年首次在挪威明确报告其致病作用。,在国内，于1973年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位。,蜡样芽胞杆菌食物中毒特征,以夏季（6-10月）为主致病
2、因子为细菌繁殖过程中产生的细菌毒素 中毒食品含菌量在106CFU/g(ml)以上 引起中毒的原因常为食品食前保存温度不当，放置时间较长或食品加热不当,引起食物中毒的主要食物种类,美国 炒米饭欧洲 甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品中国 米饭、淀粉类制品,临床表现,“腹泻型”：潜伏期为8h16h，主要症状为水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约24h。“呕吐型”：潜伏期为0.5h5h，症状以恶心、呕吐为主，病程不超过24h。,引起食物中毒的原因肠毒素,腹泻毒素：为大分子量蛋白质，引发腹泻型综合症,能在各种食物中形成;呕吐毒素：为小分子量、热稳定多肽，100 30min不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常
3、在米饭中形成。,新国标编制说明,新国标编制说明,第一版标准：食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验（GB/T 4789.14-1984）该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重要的作用。,背景,在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准经过1994年、2003年二次修订，但内容可以说完全与1984年版相同。,现行GB/T 4789.14-2003标准不足处,1.对蜡样芽胞杆菌含量少于1000cfu/g的样品计数效果差。2.采用的361培养温度并非是蜡样芽胞杆菌最适生长条件。3.检验结果与现行的其它国家的标准存在一定差异。,提高检出率,蜡样芽胞杆菌的
4、最佳生长温度为3032。经标准修订协作组验证：蜡样芽胞杆菌在MYP培养基的培养条件以 30 1 培养48h的生长率最高，平均生长率达到了93.69%。其次为30 1 培养24 h，平均生长率为92.28%。生长率最低的培养条件为36 1 培养24 h。平均生长率为82.32%。,提高检出率,经统计学分析，30 1 培养温度的生长率显著高于36 1(P0.05），但在培养温度相同的情况下，培育时间24h和48h蜡样芽胞杆菌生长率无显著差异（P0.05）。,表1 MYP培养条件选择结果,扩大检测范围,增加了MPN法以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于103 cfu/mL时用平板计数法计数不准的问题
5、美国FDA、ISO、以及SN 0176-92标准除采用平板计数外，还采用了MPN法 该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。,便于与国际接轨,增加了根状生长试验和溶菌酶试验。,提高方法的适用性和可操作性,描述具体化,提高方法的可操作性 样品处理和制备等与其它标准匹配，提高方法的适用性考虑我国的实际情况，保持与原标准的连续性,新标准与GB/T 4789.14-2003相比主要修改如下:,修改了标准名称；增加了“第二法 蜡样芽胞杆菌MPN 计数法”；将选择性分离培养基（MYP）培养条件由37 培养12 h-20 h改为30 1 培养24 h-48 h；增加了根状生长试验和溶菌酶试验；增加
6、了典型菌落计数和确认；增加了附录A、附录B。,食品安全国家标准 食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验（修订版）,标准修订单位,浙江省疾病预防控制中心国家食品安全评估中心吉林省疾病预防控制中心江苏省疾病预防控制中心广东微生物研究所,1 范围,本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。本标准适用于各类食品及食物中毒样品中的蜡样芽胞杆菌检验,2 设备和材料,2.1 冰箱：2-5。2.2 恒温培养箱：30 1、36 1。2.3 均质器。2.4 电子天平：感量0.1 g。2.5 无菌锥形瓶：100 mL、500 mL。2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量
7、移液器及吸头。2.7 无菌平皿：直径90 mm。2.8 无菌试管：16 mm160 mm。2.9 显微镜：10-100。,3 培养基和试剂,3.1 磷酸盐缓冲液（PBS）3.2 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)3.3 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤3.4 营养琼脂3.5 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)3.6 溶菌酶营养肉汤,第一法 蜡样芽胞杆菌平板计数法,4 检验程序,5 操作步骤,5.1 样品处理,冷冻样品应在45以下不超过15 min或在28不超过18 h解冻。若不能及时检验，应放于-15左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于28冰箱保存，在24 h内检验。,5.2样
8、品制备,以无菌操作取样品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋转刀片式均质器以8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min，或拍击式均质器拍击2 min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g（mL）置合适的容器中，加225 mL PBS，充分振荡混匀。制成1:10的样品匀液。,5.3 样品的稀释,吸取上述1:10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。,5.4样品接种,根
9、据对样品污染状况的估计，选择2个 3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。,5.5分离、培养,5.5.1 分离在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30 1 培养1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30 1 培养24 h2 h。如果菌落不典型，可继续培养24 h2 h再观察。,分离,在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉
10、红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。,5.5.2 纯培养,从每个平板中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养24 h2 h，进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm-10 mm。,营养琼脂平板纯化培养,6确证实验,6.1形态挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小为（11.3）m（35）m，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。,蜡样芽胞
11、杆菌革兰氏染色,6.2生化鉴定,挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表1。,表1 蜡样芽胞杆菌的主要生化特征,蜡样芽胞杆菌生化特征,过氧化氢酶；葡萄糖利用（厌氧）；硝酸盐还原；V-P试验；甘露醇产酸；酪蛋白分解；,6.2.1 溶血试验,挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱
12、的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。,蜡样芽胞杆菌完全溶血环（24h）,苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，巨大芽胞杆菌不溶血。,6.2.2根状生长试验,挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。,根状生长,根状生长,30，24h培养，室温放置3天后根状生长观察。,6.2.3蛋白质毒素结晶试验,取经30 1 培养24 h2 h并于室温放置3 d4 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30
13、s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。,观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应将培养物置室温2 d3 d再行检查。放置3d4d以上的苏云金芽胞杆菌培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色方法才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。,苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶,游离芽胞（浅红色
14、）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。,苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶,蛋白质毒素结晶形态观察,芽孢形成期的菱形晶体蛋白扫描电镜观察（20kv，9.5mm15.0k）,光学显微镜观察 100倍油镜,6.2.4溶菌酶耐性试验,用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，361 培养24h。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含0.01溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。巨大芽胞杆菌不生长。,6.6生化分型,可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。,7 结果计算,7.1 典型菌落计数和确认7.1.1 选择有典型蜡样芽
15、胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20 CFU200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。,公式（1）：T=式中：T样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；A某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；B鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；C用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；d 稀释因子。,式中：T 样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的
16、菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；1.1计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；,8 结果报告,根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按公式计算，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以CFU/g(mL)表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,第二法 蜡样芽胞杆菌MPN计数法,10.1-10.3 样品处理、样品制备和样品稀释同平板计数法,10.4 样品接种,取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于10 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过1 mL，则用双料胰酪胨大豆多粘菌素肉汤）。于30 1 培养48 h2 h。,10.5 培养,用接种环从各管中分别移取1环，划线接种到MYP琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。如果菌落不典型,可继续培养24 h2 h再观察。,10.6确证实验,从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养24 h2 h，进行确证实验。,11结果报告,MPN计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌的MPN值。,说明,定性检测 全自动生化鉴定方法,谢谢！,
