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1、第 七 章 植 物 胚 胎 培 养,7.1 胚胎培养的内容及意义,7.1.1 胚胎培养意义 离体胚胎培养可以克服种、属间受精障碍，打破种子休眠，缩短育种周期，克服种子生活力低下和自然不育等，对于植物界物种的进化具有极其重要的意义。,（一）植物受精不育的机理（二）打破种子休眠（三）缩短育种周期（四）克服种子生活力低下提高萌发率（五）克服种子的自然不育性（六）种子生活力的测定,内容,（一）植物受精不育的机理,（1）自然界两种隔离机制。植物界由于长期自然选择的结果，产生两种隔离机制：拒绝异种受精，杂交不亲和现象在种，属以上的植物杂交中，常常可以见到，由于杂交不亲和性的存在，才能保持物种的遗传稳定性。
2、拒绝自花受精，由于自交不亲和现象的存在，才能确保物种具有强生活力。,（2）植物受精不育障碍的表现形式,花粉在柱头上不萌发，或萌发后花粉管不能伸入花柱或生长缓慢，使配子丧失受精机会。这类不育障碍，可采用试管受精的方法克服。花粉管生长正常，有配子融合但由于胚败育而引起的受精不育。胚败育的原因：可能是胚乳早期败育或胚胎发育和珠心组织发育不同步。有配子融合，但缺乏同源染色体，染色体配对上出现障碍。培养时可以兼用秋水仙素染色体加倍，可等到可育植株。,（二）打破种子休眠,种子休眠的原因很多，但是能利用幼胚培养打破种子休眠的情况有如下两种：（1）种胚发育不全（2）抑制物质抑制种胚发芽,（三）缩短育种周期,柑
3、橘（芸香科）为多胚植物，除正常有性胚外，还可以从珠心组织发生多个不定胚。常规杂交育种中，不定胚干扰了对有性胚的识别。再者，不定胚的生长势强，具有很强的竞争力，因而影响柑橘杂交育种的结果。利用胚离体培养的方法，可以使合子胚正常发育成植株。,（四）克服种子生活力低下提高萌发率,杂交育种中以某些种的早熟种为母本而获得的杂种，种子生活力低下，甚至经过冷藏处理也不能萌发。例：“京早3号”早熟桃（杂交种）熟性比一般早熟桃提前1520d。在25正常冷处理，60d后播种，出苗极不整齐。在25预冷后取胚接种培养，57d后萌发，2030d长成46cm高的苗（覃兰英，1974）。,（五）克服种子的自然不育性,长期营
4、养繁殖的植物，具有形成种子的能力，但它们的种子常是无生活力的。胚胎培养有可能促进这类种子的萌发和形成幼苗。,（六）种子生活力的测定,测定休眠后的种子生活力，应用一般的种子萌发试验需很长时间，特别是木本植物需要层积处理打破休眠。Tukey（1944）发现未经层积处理的和经层积处理的种胚，离体培养条件下萌发速率一致。因此，这一方法用于快速测定种子生活力已被广泛采用。,总 结胚胎培养的意义,1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种2、获得单倍体和多倍体植株3、打破种子休眠，促进胚萌发4、快速繁殖良种，缩短育种周期5、克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率6、种子活力的快速测定7、种质资源的搜集和保
5、存8、研究胚胎发育的过程和控制机制,7.1.2 胚胎培养的内容和概念,胚胎培养是植物组织培养的一个主要领域。植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。,主 要 内 容,(一)胚培养(二)胚珠培养(三)胚乳培养(四)试管受精,(一)胚培养1）成熟胚培养：指子叶已形成的种胚。仅提供一定温度、湿度就可以发芽长成植物体。如种子发芽。2）幼胚培养：胚龄处于原胚期、球型期、心型期、早鱼雷期的幼胚的培养。这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度均不能发芽。在远缘杂交育种上幼胚培养有极大的利用价值。,(二)胚珠培养,1）未受精的胚珠的培
6、养，目的是为试管受精提供雌配子体；也可诱发大孢子发育成单倍体植株。2）受精后胚珠的培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段，从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。如兰科的成熟胚很小，采用胚珠培养较易成功，也同样能达到使胚发育成幼苗的目的。,(三)胚乳培养 指处于细胞期胚乳的离体培养。(四)试管受精 指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。,7.2 胚 培 养,植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，
7、一般可分为成熟胚和幼胚培养。,7.2.1 离体胚培养的方法,（一）成熟胚 将受精（传粉）后的果实或种子（带种皮）用药剂进行表面灭菌，然后在无菌操作台上，剥出种胚接种于预先配制好的培养基上，使裸露的胚，在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体。,种子植物离体的成熟胚，在只含大量元素的无机盐和糖的培养基上就可萌发生长。对成熟胚的培养而言，大多是利用这种技术来研究胚发育过程的形态建成、生长物质的作用、各部分的相互关系，以及营养要求等生理问题。,（二）幼胚 发育早期的幼胚，由于胚胎发育要求更为完全的人工合成培养基，而且剥离技术要求很高，用成熟胚的培养方法很难成功，可以采用胚珠预培养的方法。具体做法：
8、将授粉后的子房剥出用药剂进行表面消毒，在无菌条件下切取胚珠进行预培养。培养一定时间后，再将胚从胚珠中剥出，接着培养裸露的胚，使其在人工控制的条件下，发育成一棵完整的植物体。,从离体胚到完整的植株，其发育途径有3条：1、正常胚胎发育途径 2、脱分化形成愈伤组织 3、早熟萌发产生畸形苗,7.2.2 胚龄与胚性发育的关系,不同发育时期的幼胚，离体培养成功率差异很大。一般胚龄越大成功率越高，相反胚龄越小成功率越低。处于原胚期的幼胚即使采用胚珠预培养的方法，也仅有少数植物种能够成功，如烟草、矮牵牛、朱顶红、棉花。离体培养中幼胚培养的成功率主要取决于培养基的组成。,胚龄 胚长度（m）营养需要（培养基营养）
9、早球形胚 2060 小于40m长的胚尚不清楚 后球形胚 6180 大量、微量、VB1、VB6、烟酸、糖2、IAAO.1mg/L十KTO001 mgL 心形胚 81450 大量、微量、VB1、VB6、烟酸、糖2 鱼雷胚 451700 Ca（NO3）2480、KNO363、KCl42、MgSo463 KH2Po442、VB1、VB6、烟酸、糖2 成熟胚（手杖胚）最大极限（700m）Ca（NO3）2480、KNO363、KCl42、MgSo463、糖 2,例：Raghavan(1966)对不同发育时期的荠菜胚进行离体培养，了解荠菜胚发育的营养需要（表7l）。,结果表明：,（1）培养已分化的成熟胚，只
10、需提供简单的营养元素。即在含有大量元素无机盐和糖的培养基上，成熟胚就能萌发成一棵正常植物体。（2）培养未分化的幼胚，要求完全异养的条件。对培养基要求高。除要求提供大量和微量无机盐混合物外，还需提供有机物（维生素类）和植物激素。（3）早球胚期（204m）的幼胚更难培养。因为它们的营养需要尚不清楚。,适宜胚胎培养的基本培养基和附加物,基本培养基：Tukey（1934）Rangaswamy（1961）RandilphCox（1943）Norstog（1963）Rijven（1952）White（1963）NitsCh（1953）Rappaport（1954）,附加物：维生素类：除常用的VB1、VB6
11、、烟酸外，还有生物素、泛酸钙、VC氨基酸类：除甘氨酸外，还有谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸胺、天冬酰胺核酸及其水解物：腺嘌呤（ADE）、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘧啶、水解酪蛋 白，酵母提取物、椰乳、麦芽提取物等植物激素：除生长素、细胞分裂素外，还有赤霉素,7.2.3 离体胚培养的技术关键,有关受精后的幼胚培养，除考虑胚龄之外，还应重视在离体条件下幼胚分化和发育的环境条件、渗透压和酸碱度条件等。,（一）培养基渗透压对胚性发育的作用 培养基渗透压，对幼胚发育的重要性，与其他器官培养一样。因为幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，具有较高的渗透压，人工培养基中要创造高渗透压的条件，渗透压的调节主要依赖于
12、糖，糖在胚培养中具有三个方面作用：调节渗透压、作为碳源和能源和防止幼胚的早熟萌发。,（1）幼胚早熟萌发的概念 在含有无机盐、有机物和蔗糖的培养基上，离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗，称早熟萌发。早熟萌发成的幼苗往往畸形、细弱，甚至不能存活。所以幼胚培养中，防止早熟萌发是非常重要的。,（2）防止幼胚早熟萌发的方法 提高培养基渗透压。胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高，高糖浓度控制幼胚早熟萌发的效果早已被证实。下述实例阐明不同胚龄对糖浓度的要求。提高无机盐浓度。提高无机盐浓度也是为了提高培养基渗透压。可加入适量的NaCl以提高渗透压，浓度一般为020
13、4，超过08对胚有毒害作用。加人甘露醇提高渗透压。甘露醇的浓度为1l55，以部分地代替蔗糖，使幼胚在等渗条件下继续胚性发育。,（二）培养基酸碱度对胚性发育的影响,培养基酸碱度对胚性发育也是非常重要的。通常胚培养所用pH值的范围为5.2-6.3。因植物种类不同而有所差异。如：荠菜：5.47.5 桃：5.8 曼陀罗：5.0一8.1 水稻：5.0 番茄：6.50 大麦：4.9,(三)环境条件对胚性发育的影响,1）光照条件：由于胚在胚珠内发育是不见光的。一般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜。光照对胚胎发育有轻微抑制作用，离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对光的要求，还应根据植物种类来决定。光照可以促进
14、某些植物的胚转绿，利于胚芽生长，而黑暗利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。,棉花：胚先在黑暗中培养，然后转人光照下培养，子叶的叶绿素生成很慢；而转人弱光下培养的幼胚，子叶很容易产生叶绿素。芥菜：胚培养每天以 12 h光照比全暗条件好。,2）温度条件：因植物种类而异，幼胚培养与其他器官培养无多大区别。对于大多数植物的胚来说，在2530为宜，但是，早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20为好。,7.3 胚乳培养,7.3.1 胚乳离体培养的意义 被子植物的胚乳是双受精的产物，是由精细胞和二个极核融合而成，故胚乳细胞为三套染色体。但是由于胚囊类型不同，参加
15、融合的极核数目不同，胚乳的倍性亦不同。如待宵草型胶囊只有一个极核与精细胞融合，胚乳核为2n；贝母型胚囊两个极核，其中一个是n，另一个是3n，与精细胞融合后胚乳核为5n；椒草型胚囊中有8个极核，与精细胞融合后胚乳核为9n。,胚囊,至今，尚未见到胚乳细胞在自然状态下器官发生的报道。最早报道由玉米胚乳离体培养得到可连续生长的愈伤组织（Lampe等，1933）。后来在巴婆(番荔枝科)、黄瓜（葫芦科）、黑麦草（禾本科）、蓖麻（大戟科）、桑寄生科、檀香科等植物相继报道由胚乳培养得到愈伤组织。最先报道由胚乳组织培养而器官发生的是柏形外果（檀香科）的芽分化（Johri等，1965）；通过离体胚乳培养第一个得到
16、三倍体的植物是罗氏核实木（大戟科）（Johri，1978）（表72，表73）。,当前胚乳离体培养的研究进展：1)仅能形成愈伤组织的有：巴婆、黑麦草、黄瓜、檀香、小麦、沙针、美洲懈寄生、澳洲根寄生。2）达到器官分化水平的有：玉米、蓖麻、巴豆、麻疯树、变叶木、黑种草、葡萄荷叶芹、桃、柏形外果、印度五蕊寄生、白花寄生、酸细檀、怒江钝果寄生、楔叶钝果寄生。3）能形成完整植株的有：罗氏核实木、大麦、水稻、苹果、抽、橙、马铃薯、桃、荷叶芹。,目前为止，约有30种被子植物的胚乳培养，达到不同程度的细胞分裂和器官分化。说明胚乳组织也具有发育成植株的潜在能力。在应用上胚乳培养为植物界创造新种提供了一条可行途径。
17、,7.3.2 胚乳培养的方法,取有胚乳的果实或种子，进行表面灭菌，然后在无菌条件下剥离胚乳接种培养。培养时有带胚培养和不带胚培养两种方式。带胚培养胚乳组织容易成功，不带胚培养胚乳组织成功率低。,取授粉48天后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.52.0mg/l，BA0.11.0 mg/l。在2527和黑暗条件或散射光下培养,约610天胚乳开始膨大,再培养形成愈伤组织。这时应转到分化培养基上培养,分化培养基可加入0.53.0 mg/l的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后,切下不定芽,插入生根培养
18、基中，光下培养1015天,切口处可长出白色的不定根。,7.3.3 胚乳培养的技术关键,(一)胚乳发育时期的影响 双受精后的胚乳核，先分裂形成游离核。把这一时期的胚乳称为“游离核期”。继续发育后形成细胞壁，即形成许多小的细胞。这一时期称为“胚乳细胞期”，见图71。,游离胚乳核,受精卵,一受精后12小时的状态二受精后36小时的状态,球状胚体,以“游离核期”的胚乳为材料离体培养很难成功；而“细胞期”的胚乳为材料离体培养成功率较高。这一特点已被许多植物胚乳培养实例所证实，如玉米、柑橘、苹果、梨等。植物种类不同，传粉后胚乳进入细胞期的时间不同，胚乳细胞终止有丝分裂的时间不同。玉米胚乳在授粉后3-5D进入
19、细胞期，8-12D胚乳细胞处于旺盛细胞处于旺盛分裂期，22D胚乳核有丝分裂。,几种植物胚乳双受精后进入细胞期的时间 梨（锦丰、早酥）20d 黑麦草 810d 小麦 5d 大麦 5d 黄瓜 716d,(二)胚性因子的作用 胚乳组织培养中，一个值得注意的问题，即在诱导胚乳组织增殖，形成愈伤组织时，必须要有胚的存在。当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。胚对胚乳的增殖作用，有人认为是某种“胚性因子”在起作用。“胚性因子”究竟是什么？,用巴豆（Bhojwani，1968）、核实木和蓖麻（SriVastava，1971）为实验材料，将成熟胚乳组织片，在培养之前先用不同浓度的GA3，或IAA进行
20、浸泡预处理12 h、24 h、36 h、48 h，然后转移至如下两种培养基上：IAAKTCH（水解酪蛋白）；2，4-D+酵母提取物进行培养。发现用12mgL GA3（赤霉素）浸泡36 h的核实木的胚乳组织，在无胚的情况下，可形成愈伤组织并分化出绿色芽体。苹果（母锡金，1977）的胚乳培养中亦有类似的情况。说明植物激素对胚乳的增殖和分化的作用。柚子胚乳培养中，无论带胚或不带胚均可获得愈伤组织并分化成植株。不过所用的培养基中均具有赤霉素，故认为这种“胚性因子”就是赤霉素。当然GA的作用仍需继续探讨（王大元，1977）。,有人在培养葡萄和苹果未成熟胚乳组织（细胞期软组织）时，证明胚乳细胞的增殖和器官
21、分化并不需要胚的存在。后来发现在柚子、水稻、大麦未成熟胚乳培养中亦有类似情况。“胚性因子”究竟是什么？植物激素是肯定的，至于哪些激素在胚乳培养中，可起到“胚性因子”的作用，还要看植物体内内源激素的种类和含量才能判断。,(三)培养基酸碱度对胚乳组织培养的影响 根据不同植物种类进行pH值调节，不同植物种有其最适应的pH值。玉米6.l7.0 核实木5.6 蓖麻5.0 苹果6.06.2 麻疯树5.2 巴婆40,7.4 植物的离体受精,7.4.1 离体受精的概念和意义 从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称离体受精，或试管受精。,离体受精技术在克服植物受精不育障碍，
22、特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合的障碍有着极其重要的意义。重要作用有如下三点：可以克服自交不孕；使亲缘关系更远的植物进行种间或属间杂交；诱导孤雌生殖。1990年管启良等进行大麦和硬粒小麦属间试管受精，得到了试管种子和幼苗。,7.4.2 离体受精的方法,将未授粉的子房，经表面灭菌后，切开取出胚珠，接种在培养基上。然后，在试管内撒播花粉。花粉发芽后，花粉管长人胚珠内受精。受精后的胚珠进一步发育形成种子。种子能在培养基上发芽长成植株。,具体作法有5种,（1）从胎座上切下单个胚珠（裸露胚珠），接种在培养基上，然后撒播花粉的方法。（2）带着完
23、整胎座或部分胎座接种并撒播花粉的方法。（3）带着完整子房或部分子房壁接种并撒播花粉的方法。由于带着完整子房，对于解决花粉和柱头，花粉管和花柱两种形式的受精障碍不起作用。故发展到切去柱头和花柱直接在子房上散布花粉的作法。如烟草试管受精。,（4）柱头接近法。将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上。然后在柱头周围，接种异种裸露胚珠，花粉在本种植物的柱头哺育下发芽，花粉管伸长并进人胚珠受精。这一方法是解决花粉发芽和胚珠培养，在培养基组成上发生矛盾时，所采用的一种方法。（5）哺育法。将胚珠表面先蘸满有助于花粉发芽的培养基接种培养，然后在胚珠上撒播花粉使之受精。这一方法是解决胚珠存活率和花粉发
24、芽、花粉管伸长培养基发生矛盾时的作法。,7.4.3 离体受精成功的技术关键,(一)离体胚珠的成活率和受精力 试管受精的成功率与胚珠的成活率有着密切关系。提高离体胚珠成活率的关键是培养基。因此要对培养基的各种成分进行详细的筛选。诸如基本培养基、激素种类和浓度、渗透压、pH值等。,适宜胚珠离体培养而且成活率很高的培养基，往往不能使花粉萌发或不能使萌发后的花粉管伸长。其结果即使撒播花粉，也不能使胚珠受精。这一特点在多数植物种中被发现。为此需同时筛选有利于花粉萌发和花粉管伸长的培养基。,(二)花粉萌发和花粉管的生长速度 试管内撒粉后，如何保证花粉迅速发芽，并且有较高的发芽率；花粉管能迅速伸长并在受精允
25、许的时间内到达胚囊，其关键仍然是培养基。因此需对花粉萌发和花粉管伸长的适宜培养基进行筛选。培养基筛选中要注意钙和硼对促进花粉萌发和花粉管伸长的作用。,(三)花粉的灭菌 试管受精是在无菌条件下进行，所以花粉必须先进行灭菌。目前常用的花粉灭菌方法如下：(1)用新鲜花蕾浸渍灭菌，然后剥出花粉使用。由于花粉粘连，撒播不均匀，因而影响撒播质量。如若待药囊自行裂开后再用，但又不能保证花粉具有高的萌发率和受精力（率）(2)紫外线照射灭菌，照射时间约15min，但灭菌效果和受精率有一定的矛盾，因此要在灭菌率、发芽率、受精率三者之间筛选最适宜的照射时间。,（四）鉴别受精的标记性状,试管内的胚珠撒播花粉后，如何辨
26、别受精与否呢？那就需要标记性状。经对受精后标记性状的研究发现，对多数植物来说寻求适宜的标记性状是极不容易的事。对于没有标记性状的植物，只能等待最后结果，因而鉴别受精与否的时间较长。,玉米“胚乳直感”现象，是试管受精的优良标记性状。选用具有紫色胚乳的品种为父本，采用白色胚乳的品种为母本。受精后如F1代胚乳表现紫色，证明试管受精成功。所得结果无需进行其他鉴定。目前建立单个（裸露）胚珠的培养技术，尚有许多困难。特别是对受精后不久的胚珠（早球胚期）的营养需要尚不清楚。因此对胚珠培养的培养基的研制仍处于盲目阶段。,THE END,复习思考题,植物胚胎培养分为哪些类型？各有何特点和要求？胚胎培养有何重要意义？,
