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1、乳腺癌HER2的标准化检测,HER2，又名HER2/neu，c-erbB-2，表皮生长因子受体（EGFR）家族成员；原癌基因，位于17q21，编码相对分子量185KD的跨膜糖蛋白（跨膜酪氨酸激酶受体，表皮生长因子样分子），在细胞表面表达；通过参与信号传道通路的一系列活动影响细胞的增殖与分化。,HER2基因,HER2 受体跨膜二聚体的信号传导途径,1=基因拷贝数2=mRNA 转录3=细胞表面受体蛋白表达4=细胞外受体功能域释放,A=HER2 DNAB=HER2 mRNAC=HER2 receptor protein,正常,扩增/过度表达,细胞核,细胞质,细胞膜,1,2,3,4,C,B,A,HER
2、2过度表达：正常状态的10-100倍,HER2癌基因的致瘤机制：抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞的侵袭 力；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。研究表明：30以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜 癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等;2030的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。,HER2阳性患者的生存期比阴性者缩短一半以上,转移性乳腺癌患者的中位生存期,HER2 阳性8-10个月HER2 阴性17-22个月,Slamon DJ et al.Science 1987;235:17782,2004年发现淋巴结阴性患者预后与HER2状态密切相关,p=0.0
3、001Cumulative disease recurrence curves,Sun JM.Cancer 2004;101:251622,0.30.20.10,020406080100,月,HER2阳性患者平均风险曲线,HER2 阴性患者平均风险曲线,基础风险曲线,HER2 表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致,*Mainly distant metastases.*Liver and lung metastases.Lymph node metastases were analysed in all cases,except in the studies by Vincent-Salomon
4、et al(2002)and Gancberg et al(2002),where distant metastases were analysed.,StudyMasood&Bui(2000)Shimizu et al(2000)Simon et al(2001)Tanner et al(2001)Gancberg et al(2002)Vincent-Salomon et al(2002)Tsutsui et al(2002)Carlsson et al(2004),Primary tumours32%38%25%28%29%25%25%55%,Metastases32%38%22%28%
5、27%*20%*25%55%,Percentage IHC overexpression,2005年St.Gallen国际治疗指南乳腺癌危险度分级,2005 St Gallen 指南,乳腺癌初诊时需明确HER2 HER2阳性即做为高风险因子加以考虑,Goldhirsch et al 2005,CMF,cyclophosphamide,methotrexate,5-fluorouracil,预后评估预后差,疗效预测从赫赛汀的治疗中最大获益芳香化酶抑制剂的疗效优于三苯氧胺蒽环类和紫杉类的疗效优于CMF,随着肿瘤的靶向性治疗的发展，以单抗为主的分子靶点药物的不断研制应用，已成为肿瘤靶向治疗的新武器
6、Herceptin即为一种针对HER2受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物,Heceptin：一种针对Her-2/neu受体的高纯度重组DNA衍生物的人源化单克隆抗体，是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向性药物，具有高效、低毒、选择性强的特点,癌细胞表面存在着CerbB-2蛋白，受刺激后促进癌细胞的增殖 2030的癌细胞,Her-2/neu基因的蛋白CerbB-2,与CerbB-2结合阻断和抑制细胞的增殖 转移性乳腺癌病人的治疗效果 检测癌细胞表面cerbB-2存在程度决定使用,意义,靶向药物Heceptin仅对HER2扩增的乳腺癌有效 准确的检测
7、HER2有无扩增是临床应用Heceptin的绝 对必要条件，也是成功进行靶向治疗的前题和关键 HER-2扩增的乳腺癌往往提示其恶性程度高，进展迅 速，化疗缓解期短，对CMF方案化疗反应降低 乳 腺癌化疗药物环磷酰胺、阿酶素、5氟尿嘧啶等 的主要参考指标,HER-2扩增的乳腺癌对蒽环类药物和紫杉醇类药物化 疗敏感性高 HER2和拓扑异构酶II-a基因同时扩 增的乳腺癌患者，可以从蒽环类药物为基础的方案 中受益，故同时检测HER2和拓扑异构酶II-a可以筛 选出以蒽环类化疗药为基础的化疗方案候选患者 HER-2扩增的乳腺癌对三苯氧胺易产生耐药性 制 定内分泌治疗方案的有力依据 HER-2扩增的乳腺
8、癌无病生存率和总生存率低，并且 与淋巴结阳性、癌的高级别、阴性受体状态及高增 殖活性有关 预后判断的参考指标,意义,ST.GALLEN 2007 HER2：乳腺癌危险因素的新定义,低,中,高,G1T2ER/PR+,年龄2,淋巴结 1-3 和 HER2+,ER/PR-或淋巴结 4,淋巴结-,HER2+,ER/PR-或 LVI 侵润 淋巴结1-3且 HER2-,ER/PR+,淋巴结-HER2-LVI无,RISK,RISK,2007 NCCN 治疗指南HER2检测的原则,ASCO/CAP:HER2检测指南,HER2阳性：IHC HER2 3+(完整的，强的膜阳性 30%)或 FISH HER2 基因
9、扩增(HER2/CEP17 2.2 或 HER2 基因拷贝数 6 信号/核，无内对照的探针)HER2阴性：IHC HER2 0-1+或 FISH HER2 基因扩增(HER2/CEP17 1.8 或 HER2基因拷贝数 4 信号/核，无内对照的探针)不能确定：IHC HER2 2+或 FISH HER2 基因扩增(HER2/CEP17 1.8-2.2 或 HER2基因拷贝数 4-6 信号/核，无内对照的探针),HER2测定流程图,HER2的检测方法,免疫组织化学（IHC）：HER2蛋白的表达荧光原位杂交（FISH）：HER2基因的扩增显色原位杂交（CISH）：HER2基因的扩增酶联免疫分析（E
10、IA）酶联免疫吸附分析（ELISA）聚合酶链反应（PCR）,HER2阳性定义,IHC 3+,CISH+,FISH+,或,或,=,=,一抗结合于Her-2受体,二抗结合并激活底物反应显色,免疫组织化学法原理Immunohistochemistry(IHC),IHC,检测HER2表达初筛最常使用的方法。判断HER2蛋白过表达最重要的是染色方法的标准化和结果的判断。建议使用美国食品和药品管理局(FDA)批准的试剂盒。应使用EnVision法和高质量的DAB显色液以避免内源性生物素的影响。应有严格的、包括内部和外部的质量控制，须设阳性对照、阴性对照和空白对照。,IHC结果判断,先在10物镜下进行判读注
11、意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度胞质着色应忽略不计导管内癌(DCIS)的着色应忽略不计，只评定浸润癌的着色情况正常乳腺上皮不应着色应使用美国FDA批准的HercepTest评分系统,ASCO/CAP：C-erbB2 IHC的评分,0(阴性):无染色,或 10%的细胞膜微弱的 或不完整的膜染色2+(弱阳性):10%细胞弱到中等膜染色3+(强阳性):10%中等到强的完整的膜染色,30%,0,1+,2+,3+,C-erbB2,2008/12/12,HER-2 检测:IHC,抗原修复有/无,组织固定方法,抗体选择,评分标准,变异性,福尔马林固定/石蜡包埋组织,HER 基因扩增25倍（Southe
12、rn Hybridization）,Slamon et al,Science 244:712,1989,HER2“阴性”是由于组织固定后抗原被遮蔽需要行抗原修复来纠正,Courtesy Michael Press,FISH,是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。“金标准”,HER2 gene,HER2 gene,HER2 gene,双链靶基因,变性的单链DNA,与荧光标记探针复性产生荧光信号,荧光原位
13、杂交法原理 Fluorescence in situ Hybridisation(FISH),HER2探针,绝大部分是同时含有HER2基因(标记为橘红色荧光)和该基因所在的17号染色体着丝粒(标记为绿色荧光)序列的混合探针经美国FDA批准的进口探针 VS 国产探针,评价17号染色体数目和意义,HER2基因位于17号染色体上，大约有47%的乳腺癌存在17号染色体非整体性，即17号染色体不是正常的二体，而是单体或多体。绿色探针可以将17号染色体的非整体性和单纯的HER2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时，即为HER2基因扩增。加入了这个内对照，就排除了
14、单色探针(探针中仅有HER2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳性(17号染色体多体)。临床研究显示，具有这类遗传学特征的患者对治疗的反应和预后与单纯的基因扩增明显不同。,质量控制,内对照：杂交的组织、细胞中有75%的细胞核显示出双色信号时，视为实验成功，并且红、绿信号互为对照，癌与非癌细胞互为对照。外对照：应选择FISH阳性和阴性的标本片。,结果判读,杂交信号计数应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的细胞。随机计数2030个癌细胞核中的双色信号。判读标准红色信号的总数与绿色信号的总数比值2.2时，即为HER2
15、基因扩增若红、绿两信号的比值20或众多信号连接成簇时可不计算，即视为基因扩增；若比值介于1.82.2之间，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算2030个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释。注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征(4个拷贝)可能导致的计数误差。,HER2 probe,CEP 17 probe,HER2 FISH Patterns,FISHAmplified,FISHNot amplified,AneusomyNot amplifie
16、d,Courtesy Ken Bloom,FISH:PathVysionTM,无扩增,扩增,比值 2.2提示Her-2无扩增,比值 2.2提示Her-2有扩增,比值 2.2 提示Her-2无扩增,比值 2.2提示Her-2有扩增,比值介于1.82.2临界值,Aneusomy,Not amplified,IHC vs FISH,转移性乳腺癌中：HER2 检测 IHC 3+or FISH+赫赛汀的治疗效果相当,Vogel C,et al.J Clin Oncol 2002;20:71926,26,35,34,38,48,48,Response rateClinical benefit rate,Thank You!,谢谢!,
