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1、高等生物化学,主讲：董 发 才,植物逆境生物学重点实验室,生命科学学院,提 纲,、蛋白质学专题,、酶学专题,、细胞信号转导专题,、代谢专题,、核酸专题,、基因表达调控专题,、蛋白质学专题,1.蛋白质的性质及分离纯化技术,2.蛋白质高级结构形成的分子机理,3.蛋白质的结构与功能,1.蛋白质的性质及相关分离纯化技术,蛋白质为两性电解质。在等电点时，静电荷为零在电场中不移动；生物学活性最小；蛋白质的溶解度最小。,mn 带负电荷mn 带正电荷m=n 净电荷为零,1.1 蛋白质的性质,1.蛋白质的性质及相关分离纯化技术,蛋白质为大分子，其溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。蛋白质溶液为
2、亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜、电荷和布朗运动。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,等点电时的蛋白质（亲水胶体）,带负电荷蛋白质（亲水胶体）,脱水,脱水,脱水,带负电荷蛋白质（疏水胶体）,不稳定蛋白颗粒,阴离子,阳离子,碱,酸,酸,蛋白质聚集沉淀,碱,+,+,水化膜,带正电荷蛋白质（疏水胶体）,水化膜,带正电荷蛋白质（亲水胶体）,常用的蛋白质分离纯化技术,溶解度,盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀,分子大小,透析、超过滤,密度梯度离心、凝胶过滤,带电特性,电泳、离子交换层析,吸附特性
3、,吸附层析,对配体分子的亲和性,亲和层析、金属螯合层析,分配层析,1.2 亲和层析(Affinity Chromatography),许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。,1.2 亲和层析(Affinity Chromatography),亲和层析的原理：亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体
4、的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。,1.2 亲和层析(Affinity Chromatography),配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,1.3 亲和层析的发展-亲和标签法分离纯化蛋白质,Affinity Tag:Affinity tags consist of proteins or peptides with distinct amino acid sequences that are capable of a rever
5、sible,high affinity binding interaction with a spacific partner molecule.Partner Molecule（Ligand）:The binding partner molecules can be small molecules(biotin,GST,metal ions et al),peptides,chitin,oligonucleotides and so on.,1.3 亲和层析的发展-亲和标签法分离纯化蛋白质,1.3.1 构建含Affinity tag的载体；,1.3.2 将目的基因与载体重组；,1.3.3 融合基因在寄主细胞中表达；,1.3.5 破碎细胞，提取蛋白质混合物，亲和柱分离融合蛋白；,1.3.4 将配体（Ligand）与大分子载体连接，构成亲和柱；,1.3.6 切除标签序列，获得目的蛋白质。,1.3 亲和层析的发展-亲和标签法分离纯化蛋白质,3.亲和层析的发展-亲和标签法分离纯化蛋白质,谢谢大家！,
