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1、第九章 转基因技术,第一节 概述第二节 转基因鱼的构建第三节 转基因水产动物的安全性,第一节 概述,一、转基因鱼研究背景 随着基因学说的建立和遗传的物质基础DNA的发现，遗传学研究开始进入分子水平。基因功能及其调控表达机制是分子遗传学亟待回答的问题，基因转移方法被认为是研究这一问题的可能途径。,1984年，朱作言率先开展了转基因鱼研究，研制出世界首例转基因鱼，建立了第1个转基因鱼模型。之后，英国、法国、美国、加拿大和日本等几十个实验室相继开始转基因鱼研究。转基因鱼研究已经成为鱼类基因工程研究的热点领域。,基因工程(基因操作)：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转
2、入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。,转基因：指在DNA操作过程中整合到动植物受 体细胞染色体上的外源基因。转基因技术：为了能够使外源基因在动植物体内稳 定展现出相应的生物学表型，必须采 用转基因的重组子构建技术、重组分 子导入动、植物体内的转化技术、转 基因在受体细胞染色体上的稳定整合 及可控性表达技术，这些技术统称为 转基因技术。,二、转基因技术在水产动物育种中的应用(一)转基因技术在鱼类育种中应用1、改良养殖性能(1)培育快速生长特性的鱼类新品种(2)提高养殖鱼类的抗寒能力(3)提高养殖鱼类的抗病能力,转基因黄河鲤（中科院水生所）,2、生产医药生物制品 经修
3、饰含有人胰岛素基因的罗非鱼卵子，受精后孵化的鱼苗体内可呈现人胰岛素基因及其表达产物。,3、培育新型观赏鱼或其他用途 绿色水母及红色珊瑚的基因导入斑马鱼，培育出各种颜色的荧光斑马鱼。将萤火虫基因注入斑马鱼的基因组内，以测试水质污染。若水中含有聚氯联苯，斑马鱼便会发光,转荧光蛋白基因唐鱼新品系,虹鳟,(二)虾类、贝类转基因技术的研究1、虾类 孔杰(1992)运用精子介导外源基因转移到中国对虾卵子中，基因转移比率1%以上。刘萍等（1996年）采用显微微量注射方法，将羊生长激素基因导入中国对虾受精卵，基因转移比率至少在3%以上。刘志毅等（2000）用基因枪法，获得具有绿色荧光蛋白(GFP)基因表达产物
4、的转基因对虾。,2、贝类 中科院海洋所与发育生物学研究所利用电脉冲导入法将鱼生长激素基因导入去膜的贻贝受精卵内，阳性率达到41%。,三、转基因技术研究现状与前景,1、转基因动物首例转基因动物“硕鼠”（1982年）转基因鱼（1985年）转基因猪（1985年）转基因牛（1989年）转基因山羊（1991年）等成功,我国转基因鱼研究现状：研究热点：生长激素基因（鲤、草鱼、虹鳟、鲷鱼、大马哈鱼、金枪鱼等）抗冻蛋白基因（美洲似蝶、黄盖蝶、瓦氏雅罗鱼等）；抗逆性的基因等*首先在鲤鱼、鲫鱼、银鲫、泥鳅（1985）中进行，将小鼠重金属基因启动子和人生长激素基因导入受体鱼中，建立了转基因鱼模型，转基因鲤鱼、鲫鱼已
5、繁殖子一代，证实了外源基因可以通过生殖细胞传递给后代,*将小鼠重金属基因启动子和人生长激素基因导入团头鲂和鲤鱼，外源基因得到表达，具有促生长效应，其子代带有外源基因并仍具有促生长效应*获得了鲤鱼、草鱼的肌动蛋白基因启动子和草鱼的生长激素基因组合成全鱼基因，导入鲤鱼和银鲫*将大西洋条鳕抗冻蛋白基因启动子和大麻哈鱼生长激素基因、大西洋条鳕抗冻蛋白基因启动子和虹鳟溶菌酶基因组合成全鱼基因，导入团头鲂并表达,*快速生长转基因鲤鱼完成，筛选获得转“全鱼”生长激素基因黄河鲤鱼核心群200尾，生长速度比对照鱼快140%以上具备大规模苗种繁育生产能力，其F1代的大规模养殖不仅增产，而且可降低养殖成本，并为转基
6、因鱼的进一步选育提供材料转“全鱼”生长激素基因三倍体鱼平均体重增长速度比对照鱼提高15%，由此建立了转“全鱼”生长激素基因鱼高效、安全的养殖模式,发展趋势：选择适当的基因启动子寻找新的目的基因提高外源基因的整合、表达与遗传能力鱼类克隆，建立纯系转基因个体将基因转移方法和核移植方法相结合培育新品种,克隆技术克隆-无性繁殖系，同一克隆内的个体遗传构成相同例：1997年英国用绵羊乳腺上皮细胞，核移植获得克隆绵羊多莉，可由体细胞获得高等脊椎动物，故意义重大,克隆猫,动物生物反应器,动物生物反应器是利用转基因动物的乳腺组织来生产药用蛋白及其它蛋白。到2010年，所有基因工程药物中利用乳腺生物反应器生产的
7、份额将达到95%例：1991年利用牛IVE原核胚进行微注射，并得到转入牛酪蛋白人乳铁蛋白融合基因的转基因乳牛的工作，每升牛奶中含有人乳铁蛋白1克，具有“划时代”的意义,2、治疗人类遗传病,基因组研究90年代，大规模地对系统发生谱中从病毒开始到细菌、植物、动物以至人类的基因组进行描绘和DNA测序，其目的是测定不同生物所表达的蛋白质全部图谱以及确定有关基因的复杂特性和弄清能引起遗传性疾病的基因20世纪末已完成全部人类基因组图谱,3、生产生化制品,是大批量低成本生产某些生化制品的有效途径利用大规模动物培养技术生产各种生物制品得到了极大的发展例：病毒疫苗、非抗体免疫调节剂、多态生长因子、酶、激素、病毒
8、杀虫剂、肿瘤特异性抗原、通过杂交瘤细胞生产各种单克隆抗体、细胞本身、进行皮肤重植等,动物细胞培养反应器,基因工程疫苗生产线,传统育种技术与转基因技术区别？,第二节 转基因鱼的构建,生产转基因动物主要技术：1、外源基因的构建2、外源基因有效地导入生殖细胞或胚胎 干细胞3、外源基因的表达与检测,一、外源基因的构建外源基因结构一般包括：启动子(promoter)；目的基因(target gene)；转录终止信号(transcriptional termination signal),启动子 启动子是DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，它和增强子(增强转录活性的结构)一起构成了基因
9、转录的顺势作用元件。,在转基因鱼研究中，使用的启动子可归为三类：1、来自高等动物病毒基因的启动子和增强子 SV40(猿猴空泡病毒)鲤鱼、虹鳟、鲫鱼和青鳉等；RSV(禽肉瘤病毒)金鱼、斑马鱼、鲑鱼等；腺病毒是感染新生儿的一种疱疹病毒斑马鱼,2、来自高等动物的启动子和增强子 金属硫蛋白基因（MT）金鱼、泥鳅、大西洋鲑、鲇鱼的转基因研究中。,3、来自鱼类基因的启动子 将寒带比目鱼的抗冻蛋白基因（AFP）的启动子和增强子导入大西洋鲑中，抗冻蛋白在大西洋鲑的肝脏中有很强的表达。大西洋鲑的延伸因子启动子(EF1)在斑马鱼中显示较高的活性，其活性在下一代仍能被确定。近来使用的鱼类基因的启动子还有野鲤MT启动
10、子和鲤鱼的-肌动蛋白的启动子。,二、转基因鱼的构建(一)获得目的基因 目的基因：指编码特定蛋白质的结构基 因，它的表达能使转基因水产 动物产生新的表型。,首先从基因文库中得到一个含侧翼调控序列的合适的目的基因。侧翼调控序列包括位于基因编码序列上游的启动子及位于编码序列上游或下游的组织特异性增强子。,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有4000多种。,1、选择目的基因的原则(1)改变受体的代谢特征(2)改变受体对环境适应能力,2、常用目的基因(1)生长激素（GH）基因,(2)增强抗逆性的基因抗冻蛋白(AFP)基因 抗冻蛋白具有降低胞内溶
11、液凝固点的作用，存在于美洲黄盖鲽等寒冷水域的鱼体中。抗病性基因 巨细胞病毒(CMV)启动子和惜古比天蚕的抗菌肽基因斑点叉尾鮰 大西洋条鳕AFP启动子和牙鲆c型溶菌酶基因大菱鲆珠蛋白基因 鱼类耐低溶氧能力主要是由红细胞内的血红蛋白决定的，而血红蛋白的合成是由珠蛋白基因编码和调控的。,(3)报告基因报告基因：一种编码可被检测的蛋白质或 酶基因，即一个表达产物非常 容易被鉴定的基因。,报告基因必须具备的条件：已被克隆和全序列已测定表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转化的细胞中无相似的内源性表达产物报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵活度高而且重现性好,主要报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因
12、(CAT)新霉素抗性基因(neo)半乳糖苷酶基因(gal)荧光素酶基因(luc)绿色荧光蛋白(GFP),(二)基因克隆 获得的基因必须克隆到质粒或噬菌体中，并在合适的菌株中扩增。提取这种重组质粒或噬菌体DNA，用合适的限制性内切酶酶切，分离出插入载体的外源基因。,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒,DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,(三)受体鱼(受精卵)的获得 鱼类繁殖季节，选取成熟的雌、雄鱼，注射垂体或激素催产，分别收集精液和卵子，干法授精。受精卵去膜，将裸卵移至Holtfreter 溶液中，选取质好的裸卵移至手术杯中进行基因导入。,
13、(四)外源基因的导入 在外源基因导入到受体之前，最好先在容易分析的系统中进行测试，确定启动子对目的基因表达的效率。具体的做法：1、把启动子与报告基因相连，将融合基因转染进体外培 养细胞，在转染1至2天后，分析报告基因转录产物的酶 活性。2、使用(斑马鱼或青鳉鱼)模式鱼进行启动子分析。在受精后到卵裂1至4细胞时期，通过显微注射或电穿孔方法导入外源基因，在24小时之内，鱼类胚胎会扩增导入的外源基因，产生较高水平的外源基因表达产物。,鱼类基因转移中外源基因的导入方法：1、显微注射法（microinjection）(1)卵母细胞核注射(2)受精卵原核或胞质注射,卵母细胞核注射青鳉、金鱼、斑马鱼取卵：在
14、排卵前9至10小时杀鱼取卵巢，分离卵 母细胞，此时的卵母细胞处于第二次减 数分裂前期，胞核在动物极。显微注射：外源DNA注射到卵母细胞核中，当核 开始膨胀时停止注射。卵母细胞培养和人工受精：26条件下培养直 到成熟，加入精液进行人工授精，受精 卵在26条件下继续培养。6070%的卵 母细胞能够受精，大约50%的卵母细胞 能够正常发育。在存活的个体中，约 50%带有注射的外源基因。,受精卵原核或胞质注射鲤科人工催产及授精，受精后35分钟，用磨尖的镊子或用 0.25%胰蛋白酶消化去除卵膜，将裸卵移入盛有 Holtfreter培养液的平面皿中。将溶于转导液中的外源基因吸入玻璃微针，在第一次卵 裂前实
15、施外源基因的显微注射手术，将外源基因注入原 核或核附近的细胞质中。显微注射后，受体卵在Holtfreter溶液中培养发育。胚 胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀 释；发育至心跳期后，将胚胎转移到暴气的冷开水中直 至形成鱼苗。在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去 除死胚胎。,对于一些冷水性的鲑鳟鱼类来说，胰蛋白酶消化难以去除卵壳。发展了3种变通的显微注射方法：一是从受精孔将DNA溶液注入卵中，简称法；二是在受精卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注射，简称I法；三是先用硬金属针在卵壳上打一个孔，再进行显微注射，简称法。,影响基因显微注射成功的主要因素：外源DNA的浓度(一般为1ng/ul)外
16、源DNA的结构(线型分子的整合率较高)注射位点(雄性原核雌性原核细胞质)动物品系(杂种动物的受精卵最佳)注射的时期（一般为单细胞期）,2、电穿孔法（electroporation）电穿孔法又叫电脉冲法，其基本原理是利用外部高压短脉冲使细胞膜的结构改变，使之产生可逆的孔隙或孔洞，一定大小的分子包括DNA即可通过孔隙或孔洞进入细胞。,3、精子载体法 精子载体法又叫精子携带法，以精子作为外源基因的载体，通过人工授精将外源基因导入动物胚胎，从而将外源基因带入子代的基因组中而实现基因转移。有3种方式：(1)直接混合法(2)脂质体法(3)电穿孔法,4、基因枪法 基因枪法又叫高速钨微粒轰击法或粒子枪法，是通
17、过把吸附DNA的金属微粒高速打入受体细胞内，从而使外源基因导入受体细胞内的方法。该方法特别适合于细胞壁厚的植物细胞。,5、逆转录病毒感染法 将目的基因组合到逆转录病毒(RNA)染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞，进而向细胞内导入外源基因。转基因病毒有严格的宿主特异性，而鱼类转基因病毒的分析非常落后，因此此法对于鱼类法暂不适用。,6、组织注射法 有报道外源基因向体组织直接注射时，周围细胞把外源基因纳入，并且注射的外源基因被整合。例如，(1)将CAT(链霉素转移酶基因)注射到一些鱼的体侧肌肉上，从肌肉匀浆中检出CAT活性。(2)将含有合成黑色素的互补DNA质粒注射到一些鱼的体侧肌肉上，使周围体表合
18、成黑色素，体表黑化。,(五)外源基因导入后鱼卵的处理1、必须保留与注射DNA的鱼卵同一批次的鱼卵作为对照，观察鱼卵的受精率、孵化率及幼鱼的成活率。幼鱼孵出后，提取部分幼鱼的DNA作基因整合率的检测，同时留大部分幼鱼继续培养。2、区别完全的转基因鱼与嵌合体转基因鱼。3、在对转基因幼鱼的检测中，如发现有些幼鱼的DNA杂交信号很弱，则表明这些鱼可能为嵌合体。,外源基因可能只整合入动物的部分组织或细胞的基因组，这就是所谓的嵌合体动物。如果动物所有的细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，称转基因动物。,三、转基因鱼的检测 外源基因注入受体鱼受精卵后，通常会进入到核中或者未进入核中。进入
19、到核中又存在以下三种情况：1、外源基因游离于核染色体之外；2、部分同源序列插入核DNA中；3、外源基因全部插入核DNA中；,(一)整合了外源基因受体鱼的筛选1、斑点杂交 提取实验鱼DNA，消化样品，经变性后的DNA点于滤膜上，以同位素标记的外源基因片段作探针，经杂交后进行放射自显影。2、PCR法多聚酶链式反应,(二)外源基因整合的检查Southern杂交法单切点的限制性内切酶,(三)外源基因转录的检测 通常采用Northern杂交法来检测外源基因的转录。从肝等组织中提取Poly(A)mRNA，在变性凝胶电泳上分离，再将RNA转印至滤膜上，与同位素标记的外源基因片段探针杂交，放射自显影。如在特定
20、分子量位置有阳性带，就表明外源基因可转录。,(四)外源基因表达产物的检测检测方法:1、当表达产物具有酶活性而受体鱼本身又无相关的内源性酶时，可直接检测组织提取液中酶活性，了解外源基因的表达水平。如转半乳糖苷酶基因鱼的检测即采用此法。,2、当外源基因表达产物本身无酶活性(如生长激素、抗冻蛋白等)或表达水平较低时，可采用标记的特异性抗体与组织提取液或血清等进行免疫吸附反应，根据对抗体上标记物的检测，间接推断外源基因的表达水平。,根据抗体标记方法的不同，该法又可分为:免疫沉淀法；固相放射性免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附试验(ELISA)；蛋白印迹法Western blotting)；,第三节 转基
21、因水产动物的安全性,一、食用安全 食用安全性评价包括对外源基因及其代谢产物的直接毒性及外源基因的水平转移，外源基因编码蛋自的直接毒性、过敏性、抗药性等。,二、生态安全转基因鱼对生态环境的影响表现在：1、转基因鱼逃逸或释放到外界环境后，与野生物种进行交配，而导致外源基因扩散，改变物种原有的基因组成，造成物种资源的混乱。,2、转基因个体经人工定向改造，往往抗逆、抗病性强，对环境具有更强的适应性和竞争力，一旦释放到自然环境，可能破坏原有的种群生态平衡，威胁物种的遗传多样性。,3、由于转基因整合的随机性，所转移的基因很可能被整合到含有非常重要的基因所在区域，而引起插入突变。如果产生的突变基因在发育过程中十分重要，将有可能引起遗传缺陷而产生先天性疾病，甚至死亡。,复习思考题,名词解释转基因技术？如何看待转基因水产品的安全性？转基因技术在鱼类育种中的应用主要体现在哪几个方面？外源基因的检测主要有哪些方法？,
