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1、蛋白质离子交换层析技术,蛋白质离子交换层析技术,离子交换层析原理,离子交换剂,实验条件的确定,具体操作方法,常见问题及处理,应用实例,1.离子交换层析的原理,以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。蛋白质（以静电引力为主）的离子交换层析,两性分子，不同pH，所带电荷种类和数目不同,高级结构，大分子，多位点吸附,除静电力还有氢键、疏水作用、范德华力等,待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而
2、实现目标分子和杂质的分离。,2.离子交换剂,基本结构,指标,分类,2.1离子交换剂的基本结构,基质应具备的特点：机械稳定性强，适合高流速化学稳定性好，在很宽的pH范围内保持稳定，能耐去污剂、有机溶剂。球形，颗粒均匀。亲水性。高交换容量，要有较大的孔径。,水不溶性基质,活性基团,平衡离子,+,+,2.2离子交换剂的指标,交换容量：离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。膨胀度：干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。粒径：一般都在3-300m交联度及网孔结构：交联度越高，机械强度越好，耐压性能越好。电荷密度：基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白质，介质的
3、电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱且易变性。,粒径分辨率，分离效果，但流速,实际交换容量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某物质的实际容量,2.3离子交换剂的分类,根据活性基团的酸碱性质和解离性质：酸碱性质：解离性质：,阳离子交换剂：活性基团为酸性，结合阳离子阴离子交换剂：活性基团为碱性，结合阴离子,强离子交换剂：活性基团为强酸强碱弱离子交换剂：活性基团为弱酸弱碱,蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用弱离子交换剂,2.3离子交换剂的分类,由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强使得大分子结合过牢而不易洗脱，同
4、时，会造成变性。通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。,纤维素葡聚糖琼脂糖,高效型非孔型聚乙烯醇型,2.3离子交换剂的分类,开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广,2.3离子交换剂的分类,目前使用交联葡聚糖主要来自Pharmacia公司，主要有4种类型，都是以SephadexG为骨架商品名分别为SephadexA-25 SephadexC-25 SephadexA-50 SephadexC-50,2.3离子交换剂的分类,123TECHNO,Sepharose系列,SepharoseCL-6B,Bio-G
5、el系列,34m,90m,200m,90m,粒径,大孔珠状,颗粒状,Q型SP型,SepharoseHP,弱型（DEAE，ANXCM）强型（Q，SP）,SepharoseFF,Q型SP型,SepharoseBB,DE型CM型,2.3离子交换剂的分类,高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水,无孔型，交换发生在表面；有孔型，需进入基质内部再发生交换,2.3离子交换剂的分类,高效型
6、：SOURCE系列、MonoBeads系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水,3.实验条件的确定,离子交换剂,色谱柱,缓冲液,3.1离子交换剂,按规模：分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离，有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式按目的：在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除杂质，获得单一组分。目标分子的大小：选择合适孔径的基质目标分子的电荷及pH稳定性：在起始缓冲
7、液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电荷，以利于目标分子结合在色谱柱上，起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。,3.2色谱柱,通常用高径比较小的柱子离子交换柱的高度一般在5-20cm确定基本参数后，可通过直径扩大分离规模。,3.3缓冲液,缓冲离子：与功能基团带相同的电荷pH：蛋白质的pI缓冲液的pH缓冲液的种类 离子强度：离子强度利于洗脱，不利于吸附,4.离子交换的操作方法,4.1预处理,预装柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列 无需处理，直接使用。湿胶：无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液，搅匀后装柱即可干胶：
8、需溶胀。通常室温1-2d，沸水浴2h。Sephadex系列：不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。纤维素系列：制造的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅 匀后，自然沉降，倾去上清漂浮物，反复数次即可。制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用 0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl进行“碱-酸-碱”反复浸泡，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。,4.2装柱、平衡,装柱：排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注入，让介质自然沉降。保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层。平衡：用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液在pH、电导
9、、离子强度方面是否达一致。对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间很长。通常用酸或碱将pH调至起始pH；或用与起始缓冲液pH相同，但离子强度更大的缓冲液，加快pH平衡，最后用起始缓冲液平衡。,4.3上样、洗涤,上样 加样量：目的物含量为有效交换容量的10-20%。方法：预装柱，通过恒流泵加样。自装柱，采用排干法：加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。洗涤 加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流泵泵入起始缓冲液,4.4洗脱,缓冲离子：与功能基团带相同的电荷pH：蛋白质的pI缓冲液的pH缓冲液的种类离子强度：离子强度利于洗脱，不利于吸附,4.4洗脱,-般采用分部洗脱和连续洗
10、脱。分部洗脱：几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗脱优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰连续洗脱：逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率,梯度混合器,4.5色谱柱的再生与清洗,一般，高浓度盐（通常是2M的NaCl）溶液清洗对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些胶状物，用酸和碱洗脱疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或有机溶剂（70%的乙醇或30%异丙醇）逆向清洗。,琼脂糖：盐和0.5M的NaOH纤维素：盐和0.1M的NaOH葡聚糖：避免在pH小于3的环境，可用1M的NaAC 0.5M的N
11、aOH交替清洗。,5.常见问题及处理,增加柱压并轻敲柱壁的方法以除去气泡，确保在引入任何溶液时不要产生气泡样品蛋白质损失量允许的情况下，支撑物应取出并清洗用高径比较小的柱子过柱前的样品要超声或超滤处理,产生气泡树脂基质发生粘连层析柱太细细小颗粒堵柱,5.1层析速度太慢,降低初始上样缓冲液离子强度注意计算蛋白质的等电点树脂应充分平衡或用严格的再生方法,初始上样缓冲液离子强度过大树脂pH值因解吸作用而发生变化树脂未进行适当平衡或再生的树脂未洗净,5.2蛋白质不与树脂结合,树脂上的蛋白质未洗净pH值不合适或蛋白质发生沉淀水解酶破坏了目的蛋白或树脂中有微生物滋生,5.3纯化蛋白质的产率低,增强溶液离子
12、强度；更换活性高的反离子或使用去垢剂等方法解决。适当调节PH蛋白提取过程中应加水解酶抑制剂抑制蛋白水解,5.4蛋白质分辨效果差,流速太快或层析柱过短梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快上柱蛋白质过多,降低流速可采用连续洗脱等梯度变化较慢的洗脱减少上样量,6.应用实例,混合物的分离,蛋白质的柱上复性,6.1混合物的分离,Bio-Rex70层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物 眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中6个氨基（5个侧链Lys残基和一个游离的N端氨基）均能被乙酰化生成乙酰基衍生物,形成的6种单乙酰基衍生物中净电荷数相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用Bio-Rex70将它们分开。
13、,6.1混合物的分离,两步连续离子交换制备色谱分离纯化PEG-rhG-SCF 蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非PEG化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合物。因蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低，根据电荷量的差异，通过SP-SepharoseFF和SOURSE Q30作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。,6.1混合物的分离,蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低。在阳离子交换色谱，PEG化蛋白与介质结合较弱，主要出现在流穿峰中，通过洗脱液将非PEG化蛋白洗脱下来。而在阴离子交换色谱中，由于PEG的“屏蔽效应”阻碍了蛋白与交换剂间的作用，PEG化程度高的蛋白反而易被洗脱。,SP-Sepharos
14、eFF分离聚乙二醇化的rhG-CSF和未反应的rhG-CSF,SOURSE Q30阴离子交换色谱分离不同的修饰组分峰3，2，1分别代表单、双、三聚乙二醇化蛋白,6.2包涵体蛋白的柱上复性,吸附：用变性缓冲液溶解蛋白，用变性缓冲液平衡色谱柱，使伸展的变性蛋白吸附到介质表面。色谱柱有效分隔蛋白质分子，抑制分子间的聚集。复性：复性缓冲液相对于变性缓冲液，只少变性剂，其它成分都一样。变性剂的线性减少能有效抑制复性聚集体的形成，且利于蛋白在柱上的自发折叠。洗脱：用含高浓度盐的洗脱缓冲液，洗脱折叠后的蛋白。,6.2包涵体蛋白的柱上复性,离子交换层析复性rh-IFN折叠二聚体 A液（6M Urea，50mM PBS，pH7.0）溶解变性的包涵体蛋白，并用A液平衡SP-SepharoseFF柱。此时，由于高浓度的变性剂的存在，使rh-IFN去折叠并吸附到柱上，单个蛋白彼此分开。B1液（50mM PBS，pH7.0）和A液混合过柱，形成线性减少的尿素浓度梯度，以诱使吸附在柱上的蛋白复性，同时减少复性中间体的聚集。B2液（1M NaCl，50mM PBS，pH7.0）将复性后的蛋白洗脱下来。复性后的rh-IFN的纯度达 95%,蛋白收率达 54%,比活为 7.5 105 IU/mg-1,Thanks for attention,Thanks for attention,
