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1、第七章 发酵工程技术概论,第一节 概述,发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。,一、发酵的定义,1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵,1、传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁
2、产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。,2、生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,3、工业上的发酵,泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程 包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,二、发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术特点：(1)有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原
3、料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。,(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验 室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。,三、微生发酵工程发展的历史,第一阶段。20世纪以前时期，传统的微生物发酵过程来生产葡萄酒、酒
4、、醋、酱、奶酪等。1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。,第二阶段，1900-1940期间，新的发酵产品的问世。酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。第三阶段，发酵工业大发展时期，青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。,第四阶段，基因工程阶段 采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，
5、并进行繁殖和遗传下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。,四、发酵工程研究内容,菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制。发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和发酵设备。,第二节 优良菌种的选育,菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,分离思路,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物
6、中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,生产选种,在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。,工业菌种的育种方针,工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的
7、菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,工业菌种育种的方法,诱变基因转移基因重组,育种过程,包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。,选择育种方法时综合考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,工业
8、菌种改良方法,(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。,(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。,提高特定基因的表达水平,(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。(2)诱导解除基因表达抑制的突变。,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机
9、率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离
10、辐射更有效。,2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。,3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱
11、变剂，它能造成不可回复的缺突变。,原生质体育种,原生质体融合就是把两个亲株分别通过酶去除细胞壁，使菌体细胞在高渗环境总释放出由原生质膜包被着的球状体，在高渗条件下混合两个亲株的原生质体，由PEG作为助融剂使它们相互凝集发生细胞融合，接着两亲株细胞基因组由接触到交换，从而实现遗传重组，在再生细胞中就有可能挑选到较理想的重组子。,原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。,原生质体融合育种的特点,(一)杂交频率较高：细胞壁去除
12、后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。,(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。(六)提高菌株产量的潜力较大。(七)有助于建立工业微生物转化体系。,原生质体融合育种步骤,1标记菌株的筛选和稳定性验证。2原生质体制备。3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4涂布于再生培养基，再生出菌落。5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验
13、、保藏。6生产性能筛选。,第三节 发酵的基本过程,菌种种子制备发酵发酵液预处理提取精制,一、菌种,要求菌种产量高、生长快、性能稳定、溶液培养。,二、种子的制备,种子制备可以先在摇瓶中或小罐中进行，大型发酵罐的种子要经过两次扩大培养才能接入发酵罐。,三、发酵,在这一过程中微生物产生大量的目的产物，是发酵工序的关键阶段。发酵中可供分析的参数有：通气量、搅拌转速、罐温、罐压、培养基总体积、黏度、泡沫情况、菌丝形态、pH、溶氧浓度、排气中二氧化碳含量及培养基中的总糖、还原糖、总氮、氨基氮、产物含量等。,四、产物提取,发酵液的预处理和过滤提取精制,第四节 发酵方式一、分批发酵,简单分批发酵是将全部物料一
14、次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作过程。放料后再重复投料、灭菌、接种、发酵过程。它以微生物生长、各种基质消耗和代谢产物合成都处于瞬变之中为特征，整个发酵过程处于不稳定状态。,在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。在分批发酵工艺中低浓度培养基中的营养物质会迅速耗尽，引起微生物过早地从指数生长期向稳定期转变，这样，设备的利用率和产物的积累浓度都不高。,高底物浓度的优缺点,提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如底物抑制、粘度升高
15、引起的传质效率降低等。尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。,二、分批补料发酵,所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。,分批补料培养特点,分批补料培养技术是介于分批培养相连续培养之间的一种发酵技术。由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。
16、分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。,三、连续培养技术,与在密闭系统中进行的分批培养相反，连续培养是在开放系统中进行的。所谓连续培养，是指以一定的速率向发酵液中添加新鲜培养基的同时，以相同的速率流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定不变，使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。,连续发酵法,从系统外部予以调整，使菌体维持在衡定生长速度下进行连续生长和发酵。要维持这一衡定的速度，必须使发酵罐中发酵液的稀释度，恰恰等于该微生物的生长速度。大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。,恒定状态可以有效地延长分批培养中的指数生长期
17、。在恒定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞的浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。,连续发酵优点,高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；生长与代谢产物形成的两种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。,连续发酵缺点,菌种易于退化。其次是易遭杂菌污染。所谓“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一、二年。在连续培养中，营养物的利用率一般亦低于单批培养。,连续发酵的应用,采用连续发酵的
18、方法可以有效地提高产量，但是也存在着某些较难克服的困难，因此目前仅在些比较简单的发酵产品中应用，如酵母，单细胞蛋白，酒精发酵、丙酮乙醇、石油脱蜡、活性污泥废水处理等。其余产品的连续发酵尚未工业化生产。,第五节 发酵工艺控制一、培养基的营养成分,微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。,微生
19、物的营养来源,（1）碳源：构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物质，同时碳源再微生物代谢过程中被氧化降解，释放出能量，并以ATP的形式贮存于细胞内，供给微生物生命活动所需的能量。,碳素化合物的作用构成菌体成分的重要元素，产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料，同时又是化能异养型微生物的能量来源。,碳源种类糖：单糖中的己糖，寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。有机酸如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。,醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用
20、作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。正烷烃：一般是指从石油裂得到的14C至18C的直链烷烃混合物。,葡萄糖：（速效碳源）是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。,淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀。,油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比
21、糖代谢供给更多的氧。,（2）氮源,氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。就某一类微生物而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别。,氮的来源可分为无机氮和有机氮：有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。,有机氮源特点：含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。,玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，其
22、中固体物含量在50。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。,无机氮源：氨基酸、铵盐、硝酸盐、氨水等。微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。利用无机氮时应注意引起的pH变化。,实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。,(3)水,（1）水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2）渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；（3）水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4）水的比热高，能
23、有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5）水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。,(4)微量元素(无机盐类),无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：构成菌体成分；作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；作为自养菌的能源。,无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类，这是依据微生物对它们需要量的大小划分的。主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微
24、量元素。,磷：是核酸和蛋白质的必要成分，也是ATP的成分。在代谢途径调节方面，起着重要作用。促进微生物生长，但过量时，许多产物的合成受抑制。,钙：培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。镁：处于离子状态时，是许多酶的辅酶的激活剂，不但影响基质的氧化，也影响蛋白质的合成。以硫酸镁加入，但在碱性溶液中会形成沉淀。,(5)生长因子,广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。,2种子培养基(包
25、括摇瓶种子和小罐种子培养基)：,培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,种子培养基特点：1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,3发酵培养基,发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。（1）根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞
26、生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。,（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,二、温度的影响及其控制,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长
27、的温度范围较广，总体说在-1095。,温度,任何微生物的牛长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。,在发酵过程中，产热的因素有生物热和搅拌热，散热的因素有蒸发热、辐射热和显热。理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应该根据发酵的不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。例如：青霉素发酵：30（5h）、25（35h）、20（85h）、25（40h
28、）,2pH值,培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。微生物通过其活动也能改变环境的pH值。发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。,培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。培养基中的H+、OH 间接影响酶的结构和活性。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3，则pH上升；阳离子(如NH4、K+)被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向
29、于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,现在常用生理酸性物质硫酸氨和碱性物质氨水来控制培养液的pH值。它们不仅可以调节pH，还可以补充氮源。当发酵的pH和氨氮含量都低时，补加氨水，就可达到调节pH和补充氨氮的目的；反之，pH较高，氨氮含量又低时，补加硫酸氨。添加时要采用少量间歇添加或少量自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨基酸发酵采用补加尿素的方法，可同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和培养液的特性等几个目的。,3氧,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。不同微生物或
30、同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。,溶氧的变化还能反映出发酵过程中微生物生长代谢是否正常。溶氧异常减低：污染好气菌；代谢发生异常现象；设备或工艺控制发生故障或变化等溶氧异常升高：代谢异常；污染烈性噬箘体等。,通风和搅拌,通气可以供给大量的氧。通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的多少，最好按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。,搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代
31、谢物的分散。,一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定下，培养基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,种龄与接种量,种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。,大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2.节约了发酵培养的动力消耗，3.并有利于减少染菌机会，一般都将菌种扩大培养，进行两级
32、发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。,接种量的大小直接影响发酵周期。,第七节 发酵设备概述,发酵主要设备为发酵罐和种子罐，它们各自都附有原料(培养基)调制、蒸煮、灭菌和冷却设备，通气调节和除菌设备，以及搅拌器等。种子罐：以确保发酵罐培养所必需的菌体量为目的。发酵罐：承担产物的生产任务。它必须能够提供微生物生命活动和代谢所要求的条件，并便于操作和控制，保证工艺条件的实现，从而获得高产。,一、发酵罐,发酵罐的定义：是为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意的环境的容器。对于某些工艺来说，发酵罐
33、是个密闭容器，同时附带精密控制系统；而对于另一些简单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器，有时甚至简单到只要有一个开口的坑。,发酵罐系统,一个优良的发酵罐装置和组成（1）应具有严密的结构（2）良好的液体混合特性（3）好的传质相传热速率（4）具有配套而又可靠的检测、控制仪表,发酵罐的特点,（1）发酵罐与其他工业设备的突出差别是对纯种培养的要求之高，几乎达到十分苛刻的程度。因此，发酵罐的严密性，运行的高度可靠性是发酵工业的显著特点。（2）现代发酵工业为了获取更大的经济利益，发酵罐更加趋向大型化和自动化发展。在发酵罐的自动化方面，作为参数检测的眼睛如pH电极、溶解氧电极、溶解二氧化碳电极等的在线检测在国
34、外巳相当成熟。国内目前尚处于起步阶段，发酵检测参数还只限于温度、压力、空气流量等一些最常规的参数。,发酵罐的种类,发酵工业上最常用的是通风搅拌罐。除了通风搅拌发酵罐外，其它型式的发酵罐如：气提式发酵罐、压力循环发酵罐、带超滤膜的发酵罐等。,典型发酵设备,种子制备设备、主发酵设备、辅助设备(无菌空气和培养基的制备)，发酵液预处理设备，粗产品的提取设备、产品精制与干燥设备、流出物回收、利用和处理设备等。,第八节 发酵工程产品的制造实例（一）维生素B2（vitamin B2）1、组成（结构）、性质 维生素B2又称核黄素（Riboflavin），是两性化合物，极微溶于水，几乎不溶于乙醇和氯仿，不溶于丙
35、酮、乙醚。在中性与酸性溶液中稳定，但在碱性溶液中易分解。,2、生产工艺（1）维生素B2的发酵：培养基的配制 米糠油4%，玉米浆1.5%，骨胶1.8，鱼粉1.5，KH2PO4 0.1，NaC1 0.2，CaC12 0.1，（NH4）2SO4 0.02%。维生素B2发酵,（2）维生素B2的提取与结晶：用稀盐酸水解，加黄血盐和硫酸锌，除去蛋白质等杂质，加3-羟基-2-苯甲酸钠与核黄酸形成复盐进行分离精制。一般提取工艺流程如下：,（二）L-赖氨酸（L-Lysine，L-Lys）的制备（1）L-赖氨酸的结构和性质 L-赖氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。分子量为146.20，结构为：,L-L
36、ys自乙醇水溶液中得针状结晶，其盐酸盐为单斜晶系白色粉末，无臭、味苦，熔点263264，易溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚。PI为10.56，,（2）工艺过程 菌种培养 菌种为北京棒状杆菌（corymebacterium perkinense）AS l.563。斜面培养基成分（）为:葡萄糖0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，琼脂2.0，pH7.0。种子培养基成分（%）为:葡萄糖2.0，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铵0.4，玉米浆2.0，毛发水解废液1.0，pH6.87.0，CaCO3 0.5。1000ml三角瓶中种子培养基装量200ml，接种一环斜面培养菌种，30振摇（冲程7.6cm，频
37、率108次min），培养16h。,二级种子培养接种量2.5，培养48h。如此逐级扩大培养。灭菌、发酵 发酵培养液成分（）为 淀粉水解糖13.5，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铵1.2，尿素0.4，玉米浆1.0，毛发水解废液1.0，甘蔗糖蜜2.0，pH6.7，灭菌前加甘油聚醚lL（指5m3发酵罐）。在5m3发酵罐中投入培养液3吨，在1.01105Pa压力下，加热至118120灭菌30min，立即通入冰盐水冷却至30，按10（vv）比例接种，以1:0.6（vv）通气量于30发酵4251h，搅拌速度为180转min。,发酵液处理：离心除菌体；80 加热；离子交换：铵型732树脂;PH=5.0为饱和(串联)浓缩结晶：收集PH=8.014.0洗脱液（氨水洗脱）,
