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1、1,人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究,田伟 雷燕 朱凌群 陈可冀 中国中医科学院西苑医院北京中医药大学东直门医院,2,研究背景,益气活血中药治疗冠心病取得较好疗效，促血管生成可能是的重要机制之一前期研究发现益气活血中药有促进血管生成、改善心肌缺血，增强血管内皮细胞增殖与迁移的作用，但其信号转导机制和作用靶标？,3,研究背景,细胞信号通路是细胞应答内外环境信息，经信号网络整合作用调节基因表达及细胞增殖、分化、发育的途径。细胞的增殖、分化主要与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径有关。Ras是调节细胞生长的重要转导蛋白，通过Ras-Raf-MAPK最后产生级联反应观察人参三七提取物对血
2、管内皮细胞血管生成信号蛋白的作用，以阐明益气活血药促血管生成信号转导途径,4,血管生成的过程,外因 活化邻近的血管内皮细胞血管内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜及细胞外基质血管内皮细胞增生血管内皮细胞改组形成小管，随后吻合成网状并注入血流,5,研究思路,中药促进内皮细胞增殖 信号转导机制 中药作用靶点,血管生成信号通路VEGFVEGFR-2RasMAPK,信号阻断VEGFR-2Ras,6,VEGF,VEGFR,Ras,血管生成信号通路：VEGFVEGFR-2RasMAPK,7,实验1 人参和三七不同配比、浓度、时间对HUVEC增殖的影响,配比：1：1；1：2；2：1浓度：0.25mg/ml、0.5m
3、g/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml 时间：24h，48h,HUVEC 不同浓度、不同时间点生长曲线图,24h内皮细胞增殖直方图,人参三七提取物配比：2：1浓度：4mg/ml时间：培养24hHUVEC增殖作用最强,MTT,9,实验2 人参三七提取物促VEC增殖 和分泌VEGF,实验分为5组MTT 检测各组细胞增殖ELISA 检测上清VEGF含量,人参、三七能够促进HUVEC增殖和分泌VEGF,10,实验3 人参三七提取物促VEC上VEGFR-2表达,免疫组化SP法,阳性细胞光密度,阳性细胞数,人参、三七能促进VEGFR-2的表达，其作用和bFGF相当,11,实验4 人参三七提取物
4、对血管生成 信号蛋白及其mRNA的影响,检测血管生成信号通路上VEGFR-2、Ras、MAPK 蛋白及其mRNA表达 探讨益气活血中药干预后，对血管生成信号蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK表达的影响方法：western blotting;RT-PCR,12,信号蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK蛋白及其mRNA的表达,-actin,VEGFR-2,-actin,Ras,A 空白组；B bFGF组；C 中药大剂量组；D 中药中剂量组；E 中药小剂量组,各组 VEGFR-2 蛋白的表达,各组 Ras 蛋白表达比较,43 kD,43 kD,215 kD,-actin,MAPK,43 kD,46
5、 kD,各组MAPK蛋白表达条带,13,表1 各组蛋白免疫印迹杂交信号强度灰度平均值比较(n=3),注：与空白组比较，P0.05；P0.01,14,血管生成信号蛋白MARK及其-mRNA的表达,15,结果和结论,与空白组相比，中药大剂量组VEGFR-2、Ras 蛋白表达明显增强，小剂量组MAPK、Ras蛋白表达明显上调。bFGF组VEGFR-2、Ras、MAPK的表达显著增强，差异均有统计学意义（P0.05P0.01）,人参、三七可促进血管生成信号蛋白 VEGFR-2 Ras MAPK的表达可能是益气活血药促内皮增殖，产生血管生成效应的基础以上三个信号蛋白的mRNA表达未见增加,16,实验5
6、SU5416阻断对VEGFR-2下游 信号蛋白的影响及中药干预,目的：观察下游信号蛋白 Ras/MAPK表达，明确中药 作用靶点方法：加入半数抑制量的SU5416，对信号通路关键蛋白 VEGFR-2进行 IC50 阻断，中药干预SU5416：VEGFR-2 酪氨酸激酶的抑制剂，能阻断来自细胞外血管生长刺激信号和已激活信号的转化通路,SU5416阻断后，Ras表达,A：空白组 B：SU5416组 C：SU5416+中药大剂量组 D：SU5416+中药中剂量组 E：SU5416+中药小剂量组,SU5416阻断后，MAPK表达,A：空白组；B：SU5416组；C：SU5416+中药大剂量组；D：SU
7、5416+中药中剂量组；E：SU5416+中药小剂量组,19,结论,人参、三七组方可以 显著促进 Ras蛋白的表达 促进 MAPK蛋白的表达可以确定中药直接作用于Ras暂不能肯定中药是否作用于Ras下游信号蛋白MAPK,20,实验6 FPP对下游信号蛋白MARK 的影响及中药干预,目的：观察下游信号蛋白MAPK表达，明确中药靶点方法：加入半数抑制量的FPP，对Ras 进行IC50 阻断，中药干预FPP：是法尼基转移酶（FTase）的竞争性抑制剂，FPP和Ras蛋白均为FTase的底物，FPP可以竞争性抑制法尼基转移酶，从而抑制Ras信号蛋白的传导,FPP阻断后，MAPK 表达,A：空白组；B：
8、FPP组；C：FPP+中药大剂量组；D：FPP+中药中剂量组；E：FPP+中药小剂量组图8-1 各组MAPK蛋白表达条带,22,结论,人参、三七组方可以 促进 MAPK 蛋白的表达 中药直接作用于MAPK这一靶点,23,实验7 三维细胞培养HUVEC形成 血管样结构,目的：比较二维与三维培养HUVEC成血管样结构，在形态学上的差别方法：利用Transwell 构建三维培养体系,24,二维细胞培养（x10）,25,二维细胞培养（x10）,26,细胞培养第3天（x10）,27,细胞培养第4天（x10）,28,细胞培养第5天（x10）,29,LSCM逐层扫描,30,LSCM合成立体图形,31,LSCM DNA三维成像后的俯视图,32,小结,探讨了血管生成信号通路上关键蛋白的表达，初步阐明血管生成的信号转导机制运用血管生成信号蛋白阻断剂进行逐级阻断，观察中药对血管生成信号蛋白的干预作用，部分阐明了益气活血中药促血管生成作用靶标 利用Transwell成功构建三维细胞培养模型,33,谢谢各位！,
