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1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2023年3月2日3时38分,1,2023年3月2日3时38分,2,第四节,分子印迹与杂交技术,Molecular Blotting&Hybridization Technology,江黎明 2013年10月,指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization),印迹(blotting),指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。,2023年3月2日3时38分,3
2、,Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。,(heteroduplex),2023年3月2日3时38分,4,一、印迹技术(blotting),1975年Edwen Southern建立的DNA印迹杂交。,指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。,转移缓冲液,纸巾,玻璃板,（1）印迹：,电转移,真空负压吸引转移,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,重物,NC膜或尼龙膜,毛细作用转移,2023年3月2日3时38分,5,NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种DNA或RNA分子(称为探针，
3、可用同位素或非同位素标记)进行杂交。,具有互补序列的RNA或DNA标记探针结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。,（2）杂交：,（3）显示：,2023年3月2日3时38分,6,（1）特定基因序列的定性和定量分析,核酸分子杂交应用,（2）基因克隆的筛选,（3）酶切图谱的制作,（4）基因突变分析,（5）疾病的诊断,2023年3月2日3时38分,7,二、探针的种类和制备,探针(probe)的概念：,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的互补标记片段：,与待测特定核苷酸的某一段序列相互补；,有明确的标志用于后续的检测。,2023年3
4、月2日3时38分,8,探针的种类,寡核苷酸探针,基因组DNA探针,cDNA探针,RNA探针,（一）常用探针的种类,DNA探针,2023年3月2日3时38分,9,1DNA探针,双链探针:,单链探针,从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。,用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。,2023年3月2日3时38分,10,2RNA探针,早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针,主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选HIV的基因组DNA克隆、进行中的转录分析等式。,与DNA单链探针相比，RNA探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和
5、杂交信号强等优点,标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。,2023年3月2日3时38分,11,（二）核酸探针的标记,根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。,理想标记物应备条件,不影响碱基对特异性,有较高的化学稳定性,检测方法高度特异、灵敏,标记及检测方法简单,环保，无损害,价格低廉,2023年3月2日3时38分,12,优点,缺点,灵敏度和特异性极高,半衰期短,随用随标,1.放射性同位素标记探针,对各种酶促反应无任何影响,不影响碱基配对的特异性与稳定性,放射性污染,用于核酸探针标记的放射性同位素主要
6、有32P、3H和35S等；32P应用最多。,2023年3月2日3时38分,13,32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。,缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放射自显影后X胶片上的信号有时边缘不清。,r-32P ATP,a-32P dATP,*,*,3,H,2,dATP,2023年3月2日3时38分,14,当双链DNA一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶的53聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3羟基末端；同时，53的外切酶活性能从切口的5端除去核苷酸。,最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。,(1)DNA切口平移(nick tra
7、nslation)标记法,在切去切口5端核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，可使切口沿着DNA链移动；用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。,2023年3月2日3时38分,15,核酸探针的标记方法,DNA酶：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3-OH端。,大肠杆菌DNA聚合酶：53 DNA聚合酶活性；53 外切核酸酶活性。,DNA切口平移标记法示意图,2023年3月2日3时38分,16,使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。,合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长
8、度为400-600个核苷酸。,(2)DNA随机引物标记法,2023年3月2日3时38分,17,随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096,DNA聚合酶Klenow片段：保留53 DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，无53外切酶活性。,DNA随机引物标记法示意图,2023年3月2日3时38分,18,优点：,Klenow片段没有53外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针；,对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应；,产物的比活性较高，可达4109 cpm/g探针；,随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。,2023年3月2日3时38分,19,完整
9、双链DNA,-32P-dNTP,其他3 种dNTP,5 末端突出的DNA,3 末端标记的DNA,32P-末端标记的单链DNA探针,1)DNA的3末端标记,(3)DNA的末端标记,2023年3月2日3时38分,20,条件是有5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5-P后再标记,5pCpGpTpA3,5HO-CpGpTpA3,T4噬菌体多核苷酸激酶,-32P-ATP,532p-O-CpGpTpA3,37，反应10min,-32P-ATP 需150 ci/反应,2)DNA的5末端标记,碱性磷酸酶,2023年3月2日3时38分,21,标记探针的纯化,凝胶过滤层析,常用的凝胶
10、基质：Sephadex G-50、Bio-Gel P-60,选择性沉淀,乙醇存在，醋酸铵可起此作用。,2023年3月2日3时38分,22,核酸探针的标记方法,(1)DNA切口平移标记法,(2)DNA随机引物标记法,(7)RNA探针的标记,(3)DNA的末端标记,(4)cDNA探针的标记,(5)寡核苷酸探针的标记,(6)单链DNA探针的标记,2023年3月2日3时38分,23,2.非放射性标记物,优点,缺点,灵敏度较放射性同位素标记低,无放射性污染,用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光素(FITC、罗丹明)等。,稳定性好,可较长时间存放,特异性较放射性同位素标记低,2023
11、年3月2日3时38分,24,2023年3月2日3时38分,25,The method used to produce nonradioactive DNA molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.,biotin-avidin system,Dig-dUTP,HRP/AP标记抗体与Dig结合,漂洗和封闭,底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光,底物,电泳,转膜，紫外交联固定,North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记),杂交：D
12、ig标记的探针与靶DNA结合,2023年3月2日3时38分,26,别名：Vitamin H分子量：244.31水溶性好,关于生物素,结合对象：,亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono Avidin,2023年3月2日3时38分,27,North-South 杂交原理和操作流程(Biotin标记),杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合,底物在HRP催化下,反应发光,洗膜封闭,电泳,转膜，紫外交联固定,HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合,2023年3月2日3时38分,28,1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，保鲜膜包
13、裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；,2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。,后继的化学发光检测,Luminol化学发光原理,2023年3月2日3时38分,29,思考题：,三、印迹技术的种类和用途,（一）DNA印迹杂交技术,（二）RNA印迹杂交技术,（四）蛋白质印迹杂交技术,（三）其它核酸印迹杂交技术,2023年3月2日3时38分,30,（一）Southern印迹杂交,Southern印迹杂交（Southern blotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。,基本过程:,将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性，再将凝胶中的DNA分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后
14、用标记的探针检测待测的DNA。,可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。,2023年3月2日3时38分,31,Southern印迹杂交的基本步骤:,待测DNA样品的限制性内切酶消化,酶切DNA样品的电泳分离,凝胶中DNA的变性和Southern转移,探针的制备,Southern杂交,杂交结果的检测,2023年3月2日3时38分,32,2023年3月2日3时38分,33,（二）Northern印迹杂交,利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northern blotting）。,原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的
15、分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。,2023年3月2日3时38分,34,Northern 与Southern blotting的异同点,2023年3月2日3时38分,35,将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这种膜只吸附单链DNA；,用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；,用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA预杂交。,膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。,3.膜上分子杂交*,方法：,2023年3月2日3时38分,36,（三）其他核酸杂交方法,（1）菌落杂交法 co
16、lony hybridization method,对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(200)进行克隆筛选时，可采用本方法。,将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。,主平板应贮存于4直至得到筛选结果。,2023年3月2日3时38分,37,2023年3月2日3时38分,38,Screening a genomic library by colony hybridization.,（2）噬菌斑杂交法 plaque bybridization,噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。,将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬
17、菌斑，移于 硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性；,DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位 素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交；,通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬 菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与 其对应的噬菌斑,2023年3月2日3时38分,39,EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),3/2/2023 3:38 PM,40,2023年3月2日3时38分,41,（四）蛋白质印迹技术(Western blotting),根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的
18、蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。,用Western blotting检测样品中存在特异蛋白质 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 用于蛋白质分子的相互作用研究,2023年3月2日3时38分,42,(1)蛋白样品的制备,Western Blot 流程,(2)SDS-PAGE,(3)转膜,(4)封闭,(5)抗体杂交及 底物显色,（1）蛋白样品的制备,总蛋白制备,水溶液提取法：大多数蛋白质在稀盐和缓冲液中稳定性好、溶解度大；故稀盐和缓冲液是提取蛋白质最常用的溶剂。,有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙
19、醇和丙酮。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。,2023年3月2日3时38分,44,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：,Bradford法（考马斯亮蓝法）Lowry法（Folin-酚试剂法）BCA法（二喹啉甲酸）等。,各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应说明操作，测定样品浓度。,蛋白样品的变性,100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS20%甘油0.2%溴酚兰ddH2O,2SDS-PAGE上样缓冲液：,按1:1与蛋白质样品混合，95-100加热5-15min，冰上冷却后，上样20-25l，总蛋白量20-50g。,2023年3月2日3时38分,46,
20、（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,2023年3月2日3时38分,47,湿转系统,（3）转膜,2023年3月2日3时38分,48,半干转移系统,2023年3月2日3时38分,49,常用的蛋白质转移膜,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。,转膜后检测（此步可以省略）,印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,2023年3月2日3时38分,51,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）Western Blot 膜封闭液
21、（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,（4）封闭,2023年3月2日3时38分,52,HRP/AP标记抗体与蛋白结合,漂洗和封闭,底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光,底物,电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上,1)Western Blotting直接法操作流程:,（5）抗体结合及底物显色,2023年3月2日3时38分,53,优点：,1.快速（一种抗体）,2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带,缺点：,1.免疫反应性降低,2.无信号二级放大,3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,2023年3月2日3时38分,54,HRP,AP标记二抗与一抗蛋白复合物结合
22、,漂洗和封闭,Y,底物与二抗-HRP,AP反应,显色或发光,底物,电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上,一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗),2)Western Blotting间接法操作流程:,2023年3月2日3时38分,55,优点：,1.免疫特异性不受标记影响,2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）,3.多种标记的二抗可供选,4.可选择不同的Marker,缺点：,1.交叉反应引起的非特异性条带,2.额外的二抗孵育以及条件优化,2023年3月2日3时38分,56,Southern Northern Western,三种印迹技术的比较,2023年3月2日3时38分,57,2023年3月2日3时38分,58,3.简述Western Blotting间接法操作流程。与直接法相比较，主要的差别是什么？,思考题：,1.用于核酸探针标记的32P-(d)ATP主要有几种，DNA切口平移标记法、随机引物标记法和3 或5末端标记分别应该用哪种？为什么？,2.简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。,
