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1、第二节 花药和花粉培养,概念及意义,花粉及小孢子培养,花药培养,一.概念及意义,花药的结构,花药是产生花粉的主要部分，一般由四个花粉囊组成（也有两个）分左、右两半，中间由药隔相连，从花丝通入一条维管束与药隔相连，（主要提供养料，水分）囊外由囊壁包围，内生许多花粉粒，花粉粒（小孢子）成熟后，同一侧的隔壁消失而上，下连通。花药开裂（纵，横，孔，瓣裂）花粉粒散出，开始传粉。,花药的发育,幼嫩细胞,孢原细胞,初生壁细胞,造孢细胞,花粉母细胞,纤维层,中层（逐渐消失）,绒毡层（逐渐消失）,平周分裂,花药的起源：最初在花托上产生雄蕊原基成为早期的花药顶端发育：外为一层原表皮细胞以后发育成表皮内为形状相似具
2、有高度分裂能力的薄壁细胞，由于四个角隅细胞分裂速度快而形成四棱的外形即花药的雏体。每棱的表皮下出现一个或几个体积较大的细胞称为孢原细胞，经常平周分裂产生二层：周缘细胞紧贴表皮又称初生壁细胞，以后发育变化与表皮一起构成花粉囊的壁层。造孢细胞，有丝分裂形成花粉母细胞花药中部细胞分裂分化为药隔和维管束。,花粉粒的形成,花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养）花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）,两者的共同点是利用花粉（小孢子）染
3、色体数目的单倍性，培育单倍体植株，这是花药和花粉培养技术被广泛应用于植物遗传育种的主要原因。,2个概念,染色体组(Genome),一般地说，像生殖细胞中的一组大小、形状各不相同的染色体就叫一个染色体组。一个染色体组中含有的染色体数一般用 X 来表示，例如人体的一个染色体组可以表示为 X=23。,体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。,单倍体（Haploid）,如：普通小麦为六倍体，体细胞中有六个染色体组，而以它的花粉培养出的单倍体植株的细胞中就含有三套染色体组。只有二倍体生物的单倍体才是一个染色体组。所以，只要是由配子发育成的个体，无论其体细胞中含有几组染色体均叫单倍体。,diploid 植
4、物其haploid即为monoploid 玉米 2n=2x=20 n=x=10 水稻 2n=2x=24 n=x=12 柑橘 2n=2x=18 n=x=9 tetraploid植物其haploid为dihaploid 马铃薯 2n=4x=48 n=2x=24 陆地棉 2n=4x=52 n=2x=26 hexaploid植物其haploid为triploid 普通小麦2n=6x=42 n=3x=21 octoploid植物其haploid为tetraploid 草莓 2n=8x=56 n=4x=28,生物体细胞中的染色体数一般用 2N 表示，配子中的染色体数用 N 表示，如甘蓝体细胞中的染色体数为
5、2N=18，雄配子体和雌配子体的染色体数为 N=9。,单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：1、体细胞染色体数减半 2、生长发育弱，体形小、各器官明显减小；3、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。,单倍体的应用潜力 1、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 2、获得育种中间材料 3、与诱变育种相结合可以提高诱变频率 4、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 5、作为遗传工程受体更为有效 6、用作基础遗传研究的各个领域,二.花药培养,首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有300多种植物花药培养
6、成功。目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。我国通过花药培养途径曾经培育出大面积的水稻品种“寒花早”、“中花8号”等，小麦品种“京花1号”。同时还获得一大批具有育种价值的单倍体系。,花药培养的基本程序是：外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,外植体选择,供试材料的遗传背景 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。,供试材料的生理状态 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生
7、殖生长高峰期的花药诱导率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。,花粉的发育时期四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉 最适期,Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察：花粉发育时期 胚状体诱导频率()减数分裂期 0 单核早期 14 单核晚期 40 双核早期 55,花药预处理,大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。烟草、茄子 35C 72小时 水稻 10C 1014天 柑橘 3C 510天 马铃薯 4C 48小时,低温处理的作用：保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；增加有效存活的花粉数量，使较多的小孢子完成配子体到孢子体
8、发育类型的转变。,培养基,培养条件,培养,培养基,花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。附加成分：蔗糖；激素。,蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度（）2 3 4 6 10 13 17 诱导频率（）5 10 12 18 25 45 8,花药培养常用的激素有：细胞分裂素类：BA 6-benzyladenine KT kinetin Zeati
9、n 生长素类：NAA naphthalene acetic acid I A A indole-3-acetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid,高秀云等对茄子的研究表明：MS2,4-D0.5mgl-1KT 1mgl-1 n 93.8%2n 6.2%MS2,4-D 2mgl-1 KT 1mgl-1 n 4,1%2n 35.9%高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，同时，高浓度的生长素可能启动了花药壁等二倍体组织细胞分裂，从而抑制了花粉细胞分裂，从而增加了二倍体细胞发育的机会。,花药和花粉培养中单倍体形成的途径,通过胚状
10、体形成单倍体植株,胚状体发育途径,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,通过胚状体途径再生形成小植株,烟草花药培养,胚状体发育途径,芸苔属小孢子培养,通过愈伤组织形成植株 植株来源 倍性 细胞类型 embryoid n 单个花粉粒 callus n/2n/2n+单个或多个花 粉粒、花粉细胞 与花药壁细胞等。,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养,水稻花药培养,花药培养不经愈伤组织直接产生胚状体是最理想的方式，这样可免去愈伤组织和生根阶段。但多数情况是产生愈伤组织，这时要用提高细胞分裂素，降低生长素甚至不用生长素的分化培养基诱导分化产生芽。,培养
11、条件,温度-不同植物对温度的要求不同，如：柑橘在20C以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到2125C时便会有胚状体形成，而当温度提高到26 以上时又完全不能形成胚状体。-油菜若将接种后的花药在30 条件下培养23天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33C条件下培养35天，可提高成愈率和绿苗率。光照-先弱后强,关于药壁因子,Sunderland（1978）明确提出了药壁因子作用的假设。-组织学研究证实了花药壁在诱导花粉胚中起着关键作用，在烟草中，只有原来贴着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有在药室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。,花药培养生长
12、过程,(a)Anther at the onset of the culture.(b)Anther after 6 days in culture.(c,d)Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture,showing roots(c)and shoots(d).(eg)Plantlets with cotyledons(e)and with leaves(f,g)subcultured in growing medium.(h)80-day-old regenerated haploid plant from anth
13、er culture(left-hand side)and a diploid control of the same age(right-hand side).,三.花粉与小孢子培养 习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。进入单核以后则称为花粉。,花药有药壁(2n)、药隔(2n)、花粉(n)等，因此，再生植株有可能来自药壁(2n)、药隔(2n)、或起源于数个花粉(n)的嵌合体。游离花粉粒培养，再生植株为纯合体。,材料的选择（一般是四分体到单核早期）、预处理、消毒、培养基以及再生植株的染色体加倍等与花药培养基本相同。不同之处：花粉分离收集及培养方式,花粉分离收集：由于花粉包于花药内，必
14、须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法：1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。释放的花粉粒 尼龙网（孔径2060um）过滤，除去药壁等组织 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。,培养方式：一般以液体培养（花粉密度调至104-105/ml），形成愈伤组织或胚状体后转入固体培养基。直接培养：直接取新鲜花药的花粉粒进行培养的方法（培养基中可添加花药提取液）。预培养：将花药先悬浮培养2-4天（50个花药/5ml），再挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮培养。哺育培养：将在合适培养
15、基上培养裂开的花药作为哺 育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。,看护培养：将花药水平放于固体培养基上，在其上覆 盖小圆形滤纸，在滤纸滴加0.5ml含10个花粉 粒的悬浮液滴的培养方法。微室培养：将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来 放在凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。双层培养：固相和液相双层培养。,A:NLN培养基过滤灭菌B:花蕾研磨C:过滤小孢子D,E:B5悬浮F:离心G:NLN悬浮H:胚胎发生I:植株再生,小孢子培养的优越性主要体现在以下几个方面：排除了药壁、药隔、花丝等体细胞组织的干扰，获得的再生植株都是来源于单倍体的小孢子；花药培养中，有时会因花药中的某些物质而影响小孢子的启动
16、分裂，而小孢子培养则不存在这种问题；小孢子培养中，由于小孢子是游离的单倍体细胞，除不受等位基因影响外，能均匀地接触外部环境条件(如化学、物理诱变)，因此是研究转化和诱变的理想材料；便于系统观察小孢子在离体条件下的生长发育过程，是研究发育极好的材料体系：小孢子培养从每个花药中能获得更多的再生植株。,四、花药和花粉培养中雄核发育的途径及 雄核发育诱导1、雄核发育的途径（根据小孢子最初几次分裂方式的不同）小孢子发育途径（途径）单核小孢子有丝分裂形成2个等同的子细胞 营养细胞发育途径（途径）单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后，营养细胞继续分裂 生殖细胞发育途径（途径）单核小孢子进行一次正常的非均等分
17、裂后，生殖细胞继续分裂 生殖细胞和营养细胞发育途径（途径）单核小孢子进行非均等分裂后，生殖细胞和营养细胞均继续分裂，参与孢子体的形成,2、雄核发育诱导 多数物种适于雄核发育的花粉发育时期是在花粉单核晚期（即在有丝分裂即将开始、正在进行或刚刚结束时），此时对于诱导雄核发育的外界刺激最敏感。原因：烟草花粉发育的研究结果发现：烟草花粉在正常的或体内发育期间，单核小孢子在第一次有丝分裂之后能活跃地合成RNA、蛋白质和核组蛋白。但是，与rRNA合成有关的基因在第一次有丝分裂以后会关闭24小时。据研究，这一时期是花粉发育分化终端的临界期，凡是已经通过这一时期的花粉粒，都会不可逆地依一定程序进行配子体分化。
18、因此，花药培养的取材时间必须在这一时期之前，才有可能诱导花粉配子体改变发育方按孢子体方式发育。,Sunderland(1978)认为在花粉群体中具有胚胎发生潜力的花粉，是在培养前被作用于活体的因素所预先决定的，离体花粉只是起孢子体发育的触发作用和维持相继的生长作用。这些具有胚胎发生潜力的花粉粒比正常花粉粒小，细胞质染色浅，发育迟缓，称为S-花粉或E-花粉。在一个植物种或品种的花粉群体中，出现正常和非正常两种类型花粉粒的现象，称为花粉的二型性。该理论是否具有真实性和普遍性，还需要进一步的试验和观察。,五、影响花药和花粉培养的因素1、基因型 不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别。如在水稻中，籼
19、稻花粉培养力远低于糯稻。2、供体植株的生理状态和环境条件 母体植株的年龄和所经历的环境条件如：光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。,芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较,Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01,基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）,3、花粉发育时期 只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感。因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键
20、，多数植物单核期的花粉培养容易成功。,不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期,对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化,处于不同发育阶段的烟草花芽,花粉发育时期的确定,4、预处理预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导频率极低，采用低温、高温、离心等预处理方法可以促进花粉启动，提高再生频率。,高温处理（热击处理）：指花药接种
21、后，先在较高温度下（30-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。例子:如烟草，32高温；小麦，33高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）,2、化学物质处理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。,3、其它,包括射线、离心、磁场等。,Embryo,5、培养基成分 基因型不同，所需培养基种类，蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同。加入活性炭可提高花粉植株的诱导率。6、花药壁因子花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发
22、育。7、培养方式、培养温度、光照等 培养方式：固体、液体、双层 培养温度，因基因型不同，有所差别。,单倍体植株鉴定和染色体加倍,一、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）,1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。,（4）杂交鉴定法自交或测交鉴
23、定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）,二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）,（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。,单倍体植株只有配子染色体组成，生活力弱，难以长期存活。因此，对鉴定的单倍体植株应进行染色体加倍处理。,二、染色体加倍（为什么要进行加倍？）,（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素诱导（1）浸泡
24、法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理 秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理 将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。2、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）,关于白化苗,禾谷类植物的花药培养中经常会出现白化苗。-愈伤组织分化绿苗或白苗的特性是相对稳定的，绿苗和白苗混生的现象只占少数。-影响花粉白苗形成的因素有供体植物的基因型、花粉发育的时期、培养基的成分和培养条件等。-染色体结构的变异可能是白化苗的成因。,白化苗现
25、象,细胞学研究表明，分化绿苗的愈伤组织结构致密，细胞呈圆形或者椭圆形，内含物丰富，而分化白苗的愈伤组织结构较前者疏松，细胞由于内含物较少，呈不同程度的内陷，细胞壁弯曲度较大，其上有粗细分支明显的皱纹。聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究了绿色和白化花粉植株中核糖体RNA（rRNA）的组成，结果可将绿色植株的rRNA分成4条分子量带，即细胞质核糖体的25S RNA和16S RNA，而在白化植株中质体核糖体23S RNA和16S RNA不存在或含量很少。,花粉培养实例（以甘蓝小孢子培养为例）,一、材料1.供试材料2.小孢子发育时期的确定 单核靠边期至双核早期3.取材的方法 初花期至盛花期，主花序，3.0-5.
26、0 mm,二、培养基B5洗液 不含激素的B5培养基（Gamborg等，1968），13%蔗糖，pH5.8-6.0，121高压灭菌。NLN基本培养基 改良的Nitsch和Nitsch培养基（Lichter,1982）,不含激素，10-16%蔗糖（以下简称N10-N16），pH5.8，0.22m滤膜过滤除菌。B5或MS培养基 B5或MS培养基,30%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8-6.0，121高压灭菌。,三、小孢子的培养方法,取蕾(花蕾长度3-5 mm)消毒（70%乙醇30s，0.1%升汞10min，无菌水冲洗3次）分离小孢子(花蕾放入试管，加1mL B5-13，玻璃棒碾 磨，用漏斗过滤)B5悬
27、浮(小孢子过滤到离心管中，用B5洗液定容到10mL）离心（800-1000r/m，5min，重新悬浮后重复离心 两次弃上清，加入NLN培养基重悬）封装（7.5cm培养皿，密度1蕾/mL）,热激处理（暗培，32，48h）胚诱导(25暗培养2-3w，有可见胚后转至摇上 25、60rpm振荡培养1-2W)再生株诱导(B5或MS培养基，生芽、生根、继代多次)移栽（室内锻炼2-3d，取出小苗，洗净培养基，移栽到塑料杯中浇足水，用塑料袋遮盖保 湿，注意水分管理，室温放置一周，试管 苗缓活，去掉覆盖物，此时移栽到大田）,思考题1通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？2花药培养中如何选择外植体？3花药培养与花粉
28、培养有什么不同？4花药培养过程中花药为什么要经过低温处理？5花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓 度激素？,提高选择效率,F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因可以得到充分表达。单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。,低温预处理的作用机理：1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生。,
