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1、堆肥中微生物菌剂的筛选研究进展,一、研究背景二、研究现状三、研究目的四、存在问题五、研究展望六、研究方案,研究背景,随着人类社会的发展、科学技术的进步,人们越来越认识到资源和环境对人类的重要性。有机固体废物潜在的利用价值也开始为人们所认识,这不仅在于其蕴藏着大量的能源物质(C素),也在于其拥有丰富的作物所需营养物质(N、P、K和微量元素)。堆肥化过程是地球表面生态过程的一部分,地球表面残留的枯枝落叶、杂草、树皮和其他半固体的有机物不断分解后再进一步参与到物质和能量的循环中1。1李国学,张福锁.固体废物堆肥化与有机复混肥生产.北京:化学工业出版社,2000.7597,研究背景,现代的堆肥化就是在
2、人工控制下,在一定的水分、C/N比和通风条件下,通过微生物的发酵作用,将有机固体废物(包括农业废物、污泥和城市生活垃圾等)转变为腐殖质含量丰富、对环境不构成危害的有机肥料的生物化学处理过程2。堆肥被认为是处理有机固体废物实现资源化、无害化的有效方法，成为近年来的研究热点3。2 Zhu N,Deng C,Xiong Y,et al.Performance characteristics of three aeration systems in the swine manure compostingJ.Bioresource Technology,2004,95(3):319-326.3郭亮.猪场
3、废弃物强制通风静态垛堆肥系统的研究D.北京:中国农业大学,2002:5-8.,研究背景,堆肥的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，堆体的腐熟速度和固体废物的降解程度都与堆体内的微生物直接相关。近年来，国内外学者对堆肥中的微生物生态进行了一系列理论和实践的研究。堆肥中存在着非常复杂的微生物区系，在整个堆肥过程中微生物也存在非常大的变化和演替过程4。堆肥中微生物群落结构的演替是个非常复杂的过程,利用接种微生物菌剂使堆肥物料资源化、无害化己经是现阶段发展的趋势5。4朱能武.堆肥微生物学研究现状与发展前景J.氨基酸和生物资源,2005,27(4):36-40.5曾光明，黄国和，袁兴中等.堆肥环境生物与
4、控制.北京:科学出版社，2006.,研究现状,微生物在堆肥中的应用微生物菌剂的组成复合微生物菌剂纤维素降解菌的筛选变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物研究中的应用16S/18S rRNA/DNA 序列分析技术的应用,微生物在堆肥中的应用,传统的堆肥方法存在体积大、发酵时间长、无害化程度和肥力低等缺点，使其在有机肥商品化生产中的利用受到明显限制。目前大规模的堆肥化过程都会添加一定种类的微生物，利用微生物活动加速物料的发酵过程，从而从一定程度上克服传统堆肥方法的缺点6。6黄丹莲,曾光明,黄国和,等.微生物接种技术应用于堆肥化中的研究进展J.微生物学杂志,2009,25(2)60-64.,微生物菌剂的组成,
5、微生物是堆肥过程的土体。研究表明，单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性有多高，在加快堆肥化进程中都比不上多种微生物群体的共同作用。在堆肥中所用的微生物菌剂，是适用于无害化作用的有益微生物优良菌株(包括芽抱杆菌、放线菌、乳酸菌、丝状真菌和光合菌等多种微生物)，应用优化微生物生态学技术培养微生物形成的微生物菌剂7。7曾光明，黄国和，袁兴中等.堆肥环境生物与控制【M】.北京:科学出版社，2006.,复合微生物菌剂,在堆肥体系中,由于菌种之间协同作用、相互依存和各菌种对环境的苛刻要求等原因,菌种对易降解和难降解有机物的分解不是独立完成的,而是由一定的微生物菌落在起作用。复合微生物菌群是各种微生物按
6、一定的比例，进行培养和繁殖，菌群结构要合理，存在各菌种的最佳配比，不同环境条件下，菌种的比例配合不同，所以要得到高效的优势复合菌，需在最佳混合比方面进行深入研究8-9。8张陇利，刘青，等.复合微生物菌剂对污泥堆肥的作用效果研究J.环境工程报，2008，2(2):266 269.9薛智勇，王卫平，朱凤香，等.复合菌剂和不同调理剂对猪粪发酵温度及腐熟度的影响J.浙江农业学报，2005，17(6):354 358.,纤维素降解菌筛选,随着人口的不断膨胀,农业废弃物越来越多,包括稻草、谷物秸秆、水稻壳、甘蔗渣、动物粪便,日常生活的废弃纤维产品,由于纤维素具有水不溶性的高结晶结构,外围又被木质素层包围,
7、而木质素的完整坚硬外壳使其水解为可利用的糖类或细胞蛋白相当困难。所以深入研究并充分利用微生物对纤维素的降解作用,加速木质纤维素转化为腐殖质是堆肥充分腐熟的关键。,纤维素降解菌的筛选,在堆肥处理中纤维素属于难降解成分，是限制堆肥速度的因素，许多人都在致力于纤维素分解菌的分离和筛选，来加速纤维素的降解。纤维素的降解与碳素的代谢密切相关，纤维素在纤维素酶的作用下被分解形成腐殖质，释放碳素养分。但单一菌种很难起到好的降解效果，接种 VT 菌比空白纤维素酶活性高，有利于堆肥中纤维素的分解10。10 史玉英,沈其荣,娄无忌,等.纤维素分解菌群的分离和筛选.南京农业大学学报,1996,19(3):5962,
8、纤维素降解菌的筛选,纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。至今,已有很多关于纤维素酶生产菌的报道,其中有细菌、放线菌和丝状真菌等，纤维素的微生物降解中一个重要课题就是不断选育出具有高降解功能的新菌株。纤维素生物降解中,因为细菌纤维素酶的活性普遍低于真菌,细菌方面的研究与真菌比相对较少。,纤维素降解菌的筛选,所以,至今关于纤维素酶生产菌的报道中,对纤维素分解作用较强的菌株多是真菌菌株,而且它们几乎都是以纯培养方法分离和筛选的,对自然结构的纤维素分解能力有限。纤维素的降解是有机质堆肥降解的关键所在,故有学者用刚果红透明圈筛选法来筛选研究纤维素高效降解菌11。11吴元喜
9、,张晓昱,胡佳华,等.木质纤维素分解菌筛选及木质纤维素降解.华中农业大学学报,2007,16(6):614617。,变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物研究中的应用,目前,虽然大多数研究者仍采用传统的培养方法分离和纯化堆肥过程中的各种微生物,研究其特性和演替规律,但一些新的分析方法和技术也被逐渐采用。如应用Biolog system方法分离、筛选堆肥中属于专性或兼性嗜热芽孢杆菌12,用磷脂脂肪酸方法间接推测微生物的种类和特性1312 Fang M.,Wong J.W.C.Changes in thermophilic bacteria population and diversity during c
10、omposting of coal fly ash and sewage sludge.Wa-ter,Air and Soil Pollution,2000,124(3/4):33334313 Carpenter-Boggs L.,Kennedy A.C.,Reganold J.P.Use of phospholipid fatty acids and carbon source utilization patterns to track microbialcommunity succession in developing compost.Applied and Environmental
11、Microbiology,1998,64(10):40624064,变性梯度凝胶电泳在堆肥微生物研究中的应用,然而这些方法仅限于可以培养的微生物,现代分子生物学中的变性梯度凝胶电泳分析方法不仅适用于通过普通培养方法得到的微生物,还能够分离到难以或无法用常规方法培养的细菌或厌氧菌,以及混合微生物群落中含量很低的DNA序列,该技术无需培养,不受培养基的影响,非常适用于堆肥这种复杂环境中的微生物分析,已引起越来越多研究者的重视变性梯度凝胶电泳(DGGE)是普通凝胶电泳上发展起来的DNA分离技术。与普通凝胶电泳相比,DGGE技术具有更高的准确性和精确度,能够分离分子大小相同,但碱基顺序不同的DNA分子
12、,快速、灵敏,可以直接用于细菌染色体基因分析14。14 张彤,方汉平.微生物分子生态技术:16S rRNA/DNA方法.微生物学通报,2003,30(2):97101,16S/18S rRNA/DNA 序列分析技术的应用,建立在以16S/18S rRNA/DNA序列分析基础上的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下，不仅能对分子特性进行研究，而且能够用于数量检测和预测自然进化关系以及物种分类。16S/18S rRNA/DNA分子标记技术已被广泛应用到各种微生态研究领域中，如人畜动物胃肠道微生态、病原菌检测、石油勘探、垃圾渗滤液、土壤微生物等环境样品，在堆肥中的应用也大大促进了人们对堆肥微生物的
13、全面了解。,16S/18S rRNA/DNA 序列分析技术的应用,随着核酸数据库的不断补充和完善16S/18SrRNA/DNA 分子标记技术可以实现对复杂环境微生物进行快速、微量、准确简便的分类和检测，该技术有三个关键环节：首先要获得能够代表实际生境的微生物组成的基因组DNA；其次是构建16S/18S rRNA基因文库，克隆子数量要足够多，才能反映环境样本实际的微生物组成情况；最后进行16S/18S rDNA序列分析。,研究目的,1.去除堆肥臭味未经处理的固体废物，如垃圾、畜禽粪便等都含有大量的病原菌，易腐烂并产生强烈的恶臭，对环境有很大的破坏作用。而用自然堆肥的方法处理周期长，在堆制过程中也
14、会产生大量的臭味。经研究表明，牛粪中添加特殊微生物菌剂，在通风条件培养三天，其粪中的臭味比对照降低了85%一99%12。15张辉，刘维红，杨启银.几种微生物在牛粪堆肥中的试验研究IJI江苏农业科学，2006，:108一113.,研究目的,2.缩短堆肥时间传统堆肥升温降温时间长，研究表明，添加微生物菌剂能缩短堆肥时间，并且复合菌群处理的升温过程比单一菌群处理要快13。16刘婷，陈朱蕾，周敬宣.外源接种粪便好氧堆肥的微生物相变化研究 华中科技大学学报，2002，19(2):57一59.,研究目的,3.提高堆肥质量添加微生物菌剂的堆肥腐殖化程度明显高于自然堆肥。微生物可以降解一些难分解的物质，如纤维
15、素、半纤维素等。并且复合菌处理降解挥发有机物和纤维素的能力明显强于单一菌种的处理14。17张辉，刘维红，杨启银.几种微生物在牛粪堆肥中的试验研究IJI江苏农业科学，2006，:108一113.,堆肥微生物存在问题,目前在微生物学研究中，传统的分离纯化和培养选育方法仍然是主要的研究方法。然而据研究报道15,环境中存在的大量微生物中可以通过这种传统的分离培养方法获得的微生物种类仅有l%甚至不到l%，而从系统中分离培养得到的微生物物种却不能真实地反映堆肥中微生物群落的种群组成和变化规律。由于堆肥中的微生物菌系复杂,在整个过程中的菌种组成变化较大,用常规的实验方法和手段难以完全认识,所以极大地限制了对
16、这方面的研究。因此堆肥微生物有效关键菌种的获得以及作用机理的揭示在很大程度上依赖于新的研究方法和技术的出现，也为堆肥工艺的优化提供理论基础和技术支持。18AmannRILudwigWSehleiferK.Phylogene:icidentifieationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithouteultivation.Mierobiol.Rv.，(l):143一169,研究进展,运用分子生物学技术和手段，对堆肥微生物进行分类鉴定。运用现代先进的分子生物学技术和研究手段，可直接对堆肥微生物的总DNA进行研究，突破了菌株分离和培养的限制
17、，能够动态研究微生物群落的多样性，有助于我们更加深入全面的了解堆肥系统中微生物群落的演替规律和过程，查明堆肥中起重要作用的微生物种群并能够对其进行分子鉴定，为推动堆肥理论和技术的发展提供生物学证据，并可能发现新的微生物种.,研究进展,采用现代先进的分子生物学技术能够全面了解堆肥微生物的多样性和分类信息，但是如果能够结合分离培养技术对其进行生理生化指标的测定以得到更为透彻的了解，各种技术将在环境污染检测和控制以及废弃物资源化利用方面得到长远的发展。,研究进展,堆肥中存在着大量难以用传统方法培养的微生物,它们可能是厌氧菌或营养条件苛刻,或者菌种本身是未知的,但是这些菌种可能在堆肥过程中发挥着重要作
18、用,尤其对难降解有机物的分解是必不可少的。因此,今后应充分利用分子生物学方法进行菌种分离和鉴定,在种或属的水平上跟踪堆肥过程中所有重要菌群的变化、演替规律,以便全面深入认识堆肥过程的本质,为堆肥技术和工艺的研究提供理论基础。,研究进展,另一方面,堆肥过程的实质决定了单一的细菌、真菌、放线菌群体,无论其活性多高,在加快堆肥化进程,实现堆肥产品无害化,防止出现二次污染方面的作用都比不上多种微生物群体的共同作用。因此目前的发展趋势应是根据微生物之间的协同关系有目的地组合功能微生物和伴生菌,构建分解效率高、优势强和效果稳定的微生物组合,并对其在复杂堆肥环境中的适应能力和功能发挥进行深入的研究,对推进我国有机废弃物的资源化、无害化进程具有重要的现实意义和较高的理论价值。,研究方案,研究内容1.奶牛粪堆肥过程中微生物菌剂的分离筛选2.对筛选出的微生物菌剂的功能进行鉴定、扩繁。3.研究筛选出的微生物菌剂之间的拮抗作用，并挑选出非拮抗作用的菌剂进行混合。,研究方案,材料本实验以有机原材料，包括奶牛粪、猪粪、鸡粪、沼渣、污泥、腐殖土等为实验材料。,研究方案,技术路线:,分离菌株,筛选菌株,菌株组合,拮抗实验,堆肥实验,谢谢,
