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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,一.实验目的,1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 2.掌握垂直板电泳的操作方法,二.实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？,SDS的作用,SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种
2、复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：Lg MW=b m R+K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及
3、有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性
4、抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量,操作过程,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板)*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,配 胶,3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,*
5、水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平 5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出,6.上样：（1）marker 5l（2）细胞样品10 l+2上样buffer 10l 共20l 100沸水浴，3-5min？（蛋白变性）7.微量注射器（加样器）上样,上样量 15l*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散
6、，溢出加样孔,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析,按下式计算相对迁移率：每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定
7、才具有可靠性,五.分析计算,注意的问题,蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,？,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?电极缓冲液中甘氨酸的作用?在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,浓缩胶的作用,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选
8、Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层,常见问题及解决办法,1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素 2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量 3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系
9、统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高,4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂,试剂配
10、制,(1)30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4，1-2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/
11、L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml,（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,影响因素,1.溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 2.样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L 3.二硫键是否完全被还原,
