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1、22:54:44,荧光分光光度法测定面粉中核黄素（VB2）,一、实验目的二、实验原理三、FL-4500型气相色谱仪四、实验步骤五、数据处理六、思考题,复旦化学系教学实验中心包慧敏,22:54:44,1、掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强度的影响。2、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。3、荧光分析法基本原理和学习测绘核黄素的激发光谱和荧光光谱，标准曲线法定量分析。,一、实验目的,22:54:44,二、实验原理,1、荧光、荧光分子/荧光物质2、荧光分析法：特点、定量方法3、核黄素VB2：结构、性质、面粉中提取方法 4、荧光分光光度计：结构、原理、操作
2、,22:54:44,荧光产生的机制去活化过程,问题1.荧光、荧光分子,22:54:44,强荧光物质结构特点：、共轭 体系、刚性平面结构、取代基,如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素在溶液中有很强的荧光，而酚酞没有。如芴和联苯在相同的条件下，荧光量子产率约为1和0.18,22:54:44,影响荧光发射溶液环境因素 p.362：（a）溶剂效应：取决于荧光体和溶剂的化学结构、极性、重原子效应（b）温度：T f（c）pH 平衡解离关系 对f.max、f 均有影响,溶液荧光的猝灭 p.364荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭）引起荧光猝灭的物质称为荧
3、光猝灭剂。,22:54:44,问题2.分子荧光分析法,22:54:44,1.原子光谱与分子光谱 原子光谱：电子能级跃迁；分子光谱：电子能级、振动能级、转动能级跃迁2.吸收光谱与发射光谱 吸收光谱：从低能级向高能级跃迁，使光的强度减弱；发射光谱：从高能级跃迁回低能级，相应的能量以光的形式辐射出来3.关系 原子光谱：原子吸收光谱、原子发射光谱；分子光谱：分子吸收光谱（可见、紫外、红外吸收光谱）,光谱名称的问题：,22:54:44,原子光谱 V.S.分子光谱,原子光谱/线光谱：电子跃迁能级（单重态、三重态）分子光谱/带光谱：电子跃迁能级分子振动能级分子转动能级,22:54:44,激发光谱 荧光光谱,
4、em.max处 IFex,吸收光谱 V.S.发射光谱,22:54:44,图15-3三维荧光光谱的两种表示,（b）等高线光谱图,（a）等角三维投影图,分子荧光光度法的一些基本概念激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途？,22:54:44,荧光强度 IF 与荧光物质的溶液浓度 c 成线性关系,IF=2.3F I0 b c,b 试样的吸收光程,摩尔吸光系数,F 荧光发射的量子产率,IF 荧光强度,当 I0 及 b 一定,稀溶液中,c 试样浓度,IF=k c,I0 入射光强度,荧光定量分析的基础,22:54:44,标准曲线法（工作曲线法）,1.最大激发波长、最大吸收波长的选择；2.系列标准溶液绘制工作曲
5、线；3.测定未知溶液，查得其浓度。,标准曲线法求解K：（1）图解法（2）解析法,22:54:44,灵敏度高：测定下限在0.10.001 g/mL，比分光光度法高24个数量级。光强I与I0的信号差别 荧光发射的光强选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长 产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛，干扰物质较少,分子荧光分光光度法 v.s.紫外-可见分光光度法,22:54:44,三、F-4500型荧光分光光度计,比色皿：？,样品槽：,22:54:44,F-4500型荧光分光光度计光路图,22:54:44,1、开机Power-Xe lamp-Main启动软件 FL Solutions Progra
6、m,F-4500型荧光分光光度计的使用,22:54:44,2、波长扫描 wavelength?ScanStart Method Sample Pre-scan Measure 数据处理 ReportMethod:,F-4500型荧光分光光度计的使用,22:54:44,1、试样溶液制备 2、实验条件的选择 3、标准曲线的绘制及样品的测定,四、实 验 步 骤,22:54:44,关于核黄素VB2、面粉中提取方法,面粉主要成分淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。营养强化面粉国家标准面粉中核黄素含量110-6510-4g/L，回收率为98%105%.方法检出限410-8g/L,核黄素 又称维生素B2，
7、维他命B2 Riboflavine C17H20O6N4微溶于水；对空气、氧气稳定，对光敏感，在430440nm蓝光照射下会在525nm附近发绿色荧光；在pH67的水溶液中荧光最强，在pH为11时荧光消失。,22:54:44,面粉10g400mL烧杯加0.1mol/L盐酸100mL冷却后，用NaOH调至pH6.0-6.5，然后立即加稀盐酸至pH4.5将混合物定量转移至250mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。离心取清液，避光，待测,1、试样溶液制备,剧烈搅拌，倒入150mL沸水，维持微沸30min并搅拌使均匀分散核黄素在碱性溶液中不稳定，要边加边摇防止局部碱性过强加1滴丁醇配平，离心取上清
8、,22:54:44,（1）激发光波长、荧光波长选择吸取核黄素标准溶液1mL于25mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。暂设定荧光波长即发射光波长EX:525nm,在400-500nm波长范围对激发波长进行扫描，记录激发光谱曲线；取最大激发波长EM,在400-500nm波长范围对荧光波长进行扫描，记录荧光光谱曲线。确定最佳激发光波长、荧光波长（2）酸度选择取三个25mL容量瓶，各加入核黄素标准溶液1mL，然后分别用1:1盐酸，(5:95)醋酸，5%NaOH溶液稀释到刻度。分别测定溶液pH值，测定荧光强度，考察酸度对荧光强度的影响，从中确定最佳酸度。,2、实验条件的选择,3、标准曲线的绘制及样品
9、的测定,22:54:44,五、数据处理,1、从荧光光谱图上读出最大激发（ex）和发射波长（em）2、软件绘制标准工作曲线法3、计算面粉提取液中维生素B2的含量,22:54:44,本实验注意事项,1）溶液的配制：盐酸浓度，NaOH调节pH理论计算等2）标准溶液移取与稀释操作3）系列标液的测定顺序4）样品保存，防止光降解5）荧光仪的开关机顺序,22:54:44,六、思考题,1.在荧光测量中，为什么激发光的入射与荧光的接收不在一直线上，而呈一定角度？2.试述荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计在结构上的有哪些不同点？3.定量测定维生素B2可用的方法有哪些？试比较各种方法的优缺点。,22:54:44,氧化型,还原型,？,问题3,面粉的主要成分？淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。营养强化面粉国家标准面粉中核黄素含量110-6510-4g/L，回收率为98%105%.方法检出限410-8g/L。核黄素结构性质？对空气、氧气稳定，对光敏感，在430440nm蓝光照射下会在525nm附近发绿色荧光；在pH67的水溶液中荧光最强，在pH为11时荧光消失。,
