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1、第14章 组织工程,再生,凤凰(Chinese phoenix/phoenix)：雄的叫凤，雌的则叫凰。象征祥瑞。神话中说，凤凰每次死后，会周身燃起大火，然后其在烈火中获得重生，并获得较之以前更强大的生命力，称之为“凤凰涅磐”。,蚯蚓的再生,蚯蚓被截为两截以后，断面上肌肉组织快速溶解，然后形成新的细胞团。这时，血液中所含的白细胞也会同时集中在切面上，形成特殊的栓塞，从而使伤口快速闭合。中胚层细胞还具有十分强的分化能力，当它有创伤时，原本位于体腔内隔膜中的还没有分化的原性细胞，快速移动至伤口切面上来，并与自己已溶解的肌肉细胞连在一起，在切面上形成一个个结节状的凸起，就被称为再生芽。同时，蚯蚓体内
2、的消化道、血管，以及神经系统等组织的细胞，经过许多分裂，快速地向再生芽里不断生长。于是，切面上就会快速地再生出另外一个头来，并且另一端也会自然生出一条尾巴来。这样一条蚯蚓被截成两截以后不会死，且能够再生，于是就变成两条蚯蚓了。,器官移植,亚当的肋骨造就了夏娃,圣经中，上帝始造天地耗时七日，在第六日里用泥土按自己的形状捏成个泥人，然后吹了一口仙气于其中，亚当便有了生命。上帝造了亚当之后，让他当世间万物的主宰，还给他建了个园子来住，取名为伊甸园（Eden），其意为“乐事，愉快”，有时我们不说伊甸而称之以乐园（Paradise）。取其第七肋骨塑成女状，再吹之以仙气，遂成夏娃（意即“赋予生命”）。所以
3、女人叫WOMAN，是一个合成词，指“男人的肋骨”。,荷马所著的伊利亚特中，描绘了一个叫做凯米拉的吐火女怪，她狮头、羊身、蛇尾，并且背部及尾部又分别伸出一羊头和蛇头。在现代移植学中，凯米拉一词成为一个医学术语，译为嵌合体。美人鱼,龙,龙是中国的象征、中华民族的象征、中国文化的象征。龙是中国古人对鱼、鳄、蛇、猪、马、牛等动物，和云、雷电、虹霓等自然天象模糊集合而产生的一种神物：马头（驼、牛、扬子鳄头），象鼻，鲤鱼须，蛇身，鹿角，龟眼（兔、虎），鱼鳞，虎掌，鹰爪，牛耳，鱼尾构成的。,最早的异体器官移植报道,战国时代的典籍列子记载过一例很奇特的移植手术。鲁国的公扈和赵国的齐婴得了痼疾去找神医扁鹊医治。
4、扁鹊对公扈说：“汝志疆而气弱，故足于谋而寡于断。齐婴志弱而气疆，故少于虚而伤于专。故换汝之心，则均善矣。”扁鹊先给他俩喝了一种自治的麻醉药。然后为两人做了开胸术，取出心脏互换。接着给他俩灌服了一种神奇的药物，公扈和齐随即苏醒过来，怪疾得以治愈。医学史上第一次关于异体器官移植的报道，国际器官移植学会把扁鹊作为器官移植的鼻祖。,现代的器官移植,现代的器官移植是从肾移植开始的。最早的肾移植是在1936年，一位前苏联医生沃罗诺夫将一个尸体的肾脏移植到一位汞中毒的病人体内。病人是一位年仅26岁的青年人，由于肾衰竭已经病入膏肓，无药可救。于是沃罗诺夫给他做了手术，但是一直没有获得成功，病人在48小时后死去
5、了。,1967年12月3日，一位25岁的年轻女子不幸死于车祸，她的心脏却完好无损。45岁的南非医生巴纳德当天为一名54岁的商人成功地作了人类首例异体心脏移植手术。病人手术后顺利地度过了17天，虽然由于肺炎最终夺取了他的第二次生命，但是，这在人类器官移植史上毕竟是一个里程碑式的伟大成就。不久，巴纳德又为第二名病人移植了心脏。这一次，病人存活了18个月。1971年，他为一位心脏病人做的手术非常成功，病人换心后，居然又活了20多年，一直到1994年七月，才因中风去世。,肾移植的成功，标志着器官移植进入了临床应用阶段，也推动了器官移植的发展。1963年，肝移植和肺移植先后获得成功1966年胰腺移植也取
6、得了成功。至今全世界不下20万人接受了肾移植，并以每年2万例的速度增加着；1963年开始的肝移植到90年代已超过了14000例，最长存活者已超过了20年；心脏移植，根据国际移植中心统计已达12631例，即美国截至2000年大约就有2300人接受了心脏移植手术，并且有70%的患者生存时间至少有4年；肺移植自1967年哈斯利医生首次进行以来，至1995年止，全世界已有3809例。,问 题,异体移植 强免疫排斥反应问题，失败率极高，加之异体器官来源有限，供不应求，因而难以实施 自体移植 牺牲患者自己正常器官组织为代价 组织代用品人体相容性差，不能长久使用，还易引起感染能否用自身细胞培养修复受损的组织
7、，或再生器官替换原有器官？,组织工程,一 定义,组织工程(Tissue Engineering)是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出。,Dr.Joseph P.Vacanti,John Homans Professor of Surgery at Harvard Medical School,Germeshausen Professor of Chemical and Biomedical Engineering at MIT,Dr.Robert Lang
8、er,曹谊林等于1997 在生物材料塑型、细胞生物材科复合物的体外培养以及植入方法和技术上进行了研究改进，在裸鼠体内形成了具有皮肤覆盖的人耳廓形态软骨。这标志着组织工程技术可以形成具有复杂表面结构的软骨组织，向人们展示了组织工程研究的广阔前景，被誉为组织工程研究的一个新的里程碑，使组织工程从基础研究向临床应用的努力方面迈出了重大一步。,二 组织工程三要素,1种子细胞2支架材料3细胞因子,技术路线示意图,从材料科学角度看骨,骨是高度结构化的羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH，HA和胶原纤维及血管交织成的多空基质1-细胞成骨细胞：合成ECMs、矿物质、胶原，组装成新骨破骨细胞：分泌酶使ECMs、矿物
9、质、胶原被吸收软骨细胞合成ECMs构成软骨2-支架羟基磷灰石3-因子骨形态发生蛋白,（1）种子细胞,干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞组织来源细胞自体或异体,（2）生物材料支架 细胞外基质,生物相容性好可以生物降解,天然生物聚合物,1）蛋白质支架胶原支架：是生物系统中一种重要的不溶于水的纤维性蛋白质，构成高等动物蛋白质的1/3，是胞外基质重要的结构蛋白。根据组成的氨基酸与聚合度不同有10种。具有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其他基质分子相互作用达到组织需要的强度、弹性。成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞等合成或分泌，分布于各个部位。,2）多糖支架,壳聚糖：甲壳质是节肢动物角质内的主要结构
10、多糖，壳聚糖是甲壳质的部分拖乙酰化产物，具有阳离子性质，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等带负电荷的大分子聚集在支架内，即利于收集组织液中的生长因子。海藻酸盐：是存在于褐藻的阴离子线性多糖，具有亲水性，生物相容性好。,无机类生物材料支架,磷酸钙基生物材料：是高度生物相容性的多晶陶瓷，能进行骨整合。硫酸钙基生物材料：是骨替代的最早的材料之一。适合作为骨洞填充物。半结晶水的硫酸钙一般称为熟石膏，与水混合、成型、凝固，具有生物兼容性。,（3）生长因子,细胞的增殖与分化由各种生长因子和细胞调节,常见生长因子,表皮生长因子：是对上皮细胞增殖有很强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。神经生长因子：为神经细胞特
11、异性分泌的营养蛋白。肝细胞生长因子：为728个氨基酸残基单链组成。骨形态发生蛋白：能诱导或刺激新骨的生成。,生长因子研究与制备骨形态发生蛋白（BMPs）,1965年美国首先从骨基质中分离出骨形态发生蛋白，经过25年才得以纯化。随后克隆了相关基因。原位状态下以ng/g骨基质剂量释放足以促发骨修复，人工基质需要mg/g剂量才能促发骨修复，因此成本非常高。利用转基因技术将BMP基因转染到骨髓细胞中，再将其种植在矿化基质上，达到骨修复的目的。,三 组织工程应用1.骨修复,骨组织工程种子细胞,理想种子细胞：对机体损伤小，取材方便；体外培养定向分化为成骨细胞，增殖传代能力较强，保持良好生物活性；移植入体内
12、能适应受体生理、病理、应力等环境，高质量修复骨缺损且修复后远期效果良好；生物毒性低，组织相容性好，免疫活性低。,1 成骨细胞,原代成骨细胞接种 1d，呈不规则形（250）,第一代成骨细胞培养 10d，呈“铺路石”状（250）,培养：骨、骨膜组织-酶消化-贴块法培养-含20%胎牛血清的DMEM培养液 37 5%CO2 实验材料为SD乳鼠颅骨,2骨髓基质干细胞(MSCS),骨髓基质干细胞(BMSC)是间充质来源的干细胞，通常也被称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有祖细胞的自我增殖、定向分化特性来源：成人骨髓；成人脂肪、骨骼肌、骨外膜、骨小梁中；其他组织,骨
13、髓基质干细胞,原代骨髓基质细胞接种 3d呈长梭形、纺锤形（250）,第 1 代 MSC 培养 10d复层生长（100）,实验材料为成年大鼠 培养基未加诱导因子,3 胚胎干细胞ES,理论上胚胎干细胞embryonic stem cell是骨组织工程最佳的种子细胞来源Buttery等从大鼠的囊胚中分离出的ES体外培养，在含血清的DMEM培养基中加入维生素C、-甘油磷酸、地塞米松或把ES与胎儿成骨细胞共同培养，以培养环境进行诱导，ES可向成骨细胞分化。,4 转基因细胞,MSCs定向分化和活性的维持需要生长因子的调控，设想将生长因子基因转入MSCs，利用转基因细胞表达高生物活性内源性生长因子，调控其自
14、身生长分化，同时如能将免疫抑制基因转入异种细胞，可克服其免疫原性，扩大种子细胞范围。目前重组细胞尚处于动物试验阶段，规模化的临床应用仍需进一步深入研究。,骨的原位生物修复示意图,1)取骨髓2)分离骨髓基质干细胞（具有多能性）3)体外诱导培养成成骨细胞4)将成骨细胞与藻酸钙的复合物注射到骨缺损的部位5)修复,2-体外构建人造皮肤皮肤的结构,A 表皮B 表皮网状 棘C 真皮乳头D 真皮E 皮下组织F 毛发,组织工程皮肤的研究内容,表皮替代品 真皮替代品 含有活性细胞的复合人工皮,组织工程人造皮肤构建技术路线,构建步骤,（一）种子细胞与培养液成纤维细胞：DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素
15、等表皮角质形成细胞：DMEM+Ham F-12培养基、表皮生长因子等（二）载体聚羟基乙酸（PGA）,（三）构建成纤维细胞-PGA复合物酶法消化收集真皮成纤维细胞，接种在PGA上，加入培养液培养（四）接种表皮角质形成细胞在前面的复合物上，更换表皮角质形成细胞培养基培养5天左右,（五）双层皮肤成熟,将复合物放在可渗透膜上，进行气-液界面培养，促进表皮角质形成细胞的进一步分化。再培养1周，形成含真皮和表皮两层结构的组织工程化皮肤。,问题：血管化：血管生成是指内皮细胞构筑的毛细血管分支和伸展。血管生成有助于损伤组织的修复。毛囊结构,3神经修复工程,要构建修复周围神经缺损的人工神经移植物：首先要找出主宰
16、周围神经生长主要活动的细胞其次要寻找出细胞得以附着和生长的最佳生物材料，将这种生物材料制成最适台细胞生长发育的三维结构最佳生长因子,神经修复工程,神经胞体失去与终末器官的连系会产生凋亡；远端轴突和髓鞘崩溃，有大量吞噬细胞侵入一方面清除轴突髓鞘的碎屑，另一方面刺激原来处于休眠状态的雪旺细胞(Schwann cellSC)分裂和增生，并沿着每一根神经纤维的神经内膜和基底膜排列成柱状，形成一个潜在的管道，即Buengner氏细胞带；近端生长再生轴突通过Buengner氏细胞带，伸延到终末器官，恢复其功能：产生髓鞘，形成为有髓神经纤维,SC形成引导再生轴突生长的Buengner氏细胞带，并能分泌多种细
17、胞因子调控再生轴突生长，目前大家都选用SC作为构建人工神经的种子细胞。目前比较常用的生物材料是聚羟基乙酸(polyglyeolic acidPGA)和聚乳酸(polylactic acidPLA)制成直线的丝状有利于SC排列成线状为日后形成Buengner氏带制造有利条件。此外材料要及时降解让位给成长的有髓神经。,4 血 管 组 织 工 程,血管疾病是世界上发病率最高的疾病之一,其主要的治疗手段就是血管移植术。资料显示,每年仅美国的血管移植物就超过140 万例,我国则需750万例。异体血管移植:a.组织相容性差 b.供体严重不足自体血管移植:a.创伤修复创伤的模式;b.合适的血管的来源有限;,
18、组织工程化血管,高度组织相容性可生长性，可塑性无排异反应长期通畅，血栓形成率低,一般程序,种子细胞规模扩增 可降解材料构造设计种植细胞、组织三维培养植入体内,血管组织工程种子细胞,血管壁的内皮细胞(EC）平滑肌细胞(SMC)可定向分化的干细胞,生物相容性材料的选择,PGA 缺乏结构的稳定性,不能抵抗平滑肌细胞产生的收缩力,降解快,很难维持预先设计的形态PLA 吸收相对较慢,抗收缩力强可将PLAPLLA 和PGA 按一定比例混合,以更好地控制降解速率和保持预设形态。,体外构建自体血管方法,应用自体血管壁细胞,包括平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)和内皮细胞(endot
19、helial cells,ECs),在体外先后种植于生物可吸收材料的支架上,形成多层平滑肌细胞层和内腔单层内皮细胞层,随着支架的吸收,可建立自体血管。,血管的生成细胞、基质、生长因子的协同关系的体现,两种生长因子起作用：血管内皮生长因子（1989年明确氨基酸序列，40 kDa）促进内皮细胞生长、迁移血小板衍生生长因子抑制内皮细胞的增殖，促进平滑肌细胞的积累和血管的成熟。两者分泌的时间与量上的差异来控制血管的生成，即通过促进信号-抑制信号的整体平衡来调控。,新进展,英科学家首次用干细胞培育出人体心脏组织 http:/,内地科学家实现用胚胎干细胞再生肌腱：后腿膝盖部髌肌腱断裂的小白鼠，在植入从胚胎
20、干细胞分阶段分化而来的肌腱细胞后，又恢复了正常的活动能力。相关论文近日发表在目前干细胞研究领域最高影响专业杂志干细胞（STEMCELL）上。这是国际上第一篇关于利用胚胎干细胞培养肌腱进行修复再生的研究论文，杂志评审专家认为是具有开拓性的新颖研究。,新技术应用,支架材料表面仿生工程P297-298微重力生物反应器培养组织器官P302,四 问题与挑战,1-干细胞诱导分化技术2-种子细胞分离与培养3-接种支架材料的方法4-支架材料的设计与优化5-细胞因子的释放、与支架材料相结合的设计，种子细胞表达6-血管化7-复杂性：多细胞协同培养、分化控制8-体外组织器官再生机理有待揭示。,本节小结,本节主要内容：组织工程及其应用关键问题：组织工程三要素：种子细胞、支架材料、细胞因子,下课！,
