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1、ELISPOT技术在乙型肝炎病毒（HBV）感染研究中的应用,首都医科大学附属北京佑安医院 闫惠平 研究员，博士生导师,Margolis HS et al.Semin Liver Dis 1991;11:8492.,乙肝病毒携带者流行分布(3.6亿慢性乙肝病毒携带者):,2%低流行区,27%中度流行区,8%高流行区,乙肝病毒携带者的流行分布,HBsAg流行率在中国的地区分布,江西,山西,重庆,HBsAg流行率,黑龙江,吉林,辽宁,内蒙古,北京,天津,河北,山东,江苏,上海,浙江,台湾,福建,广东,海南,广西,云南,贵州,四川,西藏,新疆,青海,甘肃,宁夏,陕西,河南,湖北,湖南,安徽,1992年
2、全国病毒性肝炎血清流行病学调查,8%高流行区,2%7%中度流行区,HBV 携带者全球性分布,HBs Ag 携带者的分布 10%少见,HCC 每年发病率,每 100,000 人1-33-1010-150少见,HBV 携带者地理分布与肝细胞癌(HCC)发病率,HBV感染的流行情况及其严重性,全世界HBV 感染者:3.6亿 中国HBV感染者:1.3亿(2004年流行病学调查，HBsAg阳性率为8.22,接种乙肝疫苗人群为4.51，非免疫人群为9.51)。慢性乙型肝炎:3 000 万-5年后，约12%-25%发展为肝硬化,约20-23%发展为失代偿肝硬化。约6%-15%肝硬化可发展为肝细胞癌(HCC)
3、-国内80%肝细胞性肝癌与HBV感染相关 每年死于乙肝相关肝病及肝癌约30-50万人 Adapted from Feitelson.Lab Invest,1994,and from EASL Consensus Statement.J Hepato,2003,39(S1):S3-25,HBV infection,急性肝炎慢性肝炎重型肝炎（急性、亚急性、慢性）慢性HBV携带者乙肝后肝硬化原发性肝癌隐性感染(既往感染),HBV实验室诊断,生化：ALT，AST，Tbil，ALP，TP等凝血：病原学检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc HBV DNA缺少细胞免疫功能监测指标
4、,ELISPOT-细胞免疫学技术,从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞,从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能不仅适用于特异性T细胞应答的检测也可用于特异性B细胞应答的分析,ELISPOT技术的应用,疫苗研究HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性肿瘤疫苗：抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；肝癌疫苗；抗原表位筛选：丙肝CTL表位；用肽库筛选T细胞表肽；自身免疫病研究、诊断器官移植肝移植：肝移植免疫耐受;,ELISPOT-在HBV细胞免疫中的应用,抗原表位肽的筛选,某些肽段有保护作用?感染后细胞免疫功能的检测,判断乙肝病人在病程中所处的
5、免疫状态（急性期、平稳期、耐受期、恢复期）,是否具有清除病毒的能力?抗病毒治疗疗效监测,有无应答?停药后是否会反跳等;器官移植后排斥反应的预测。-但是目前能够清楚说明临床问题的报道很少,乙 肝 病 毒,HBV的感染及复制过程,HBV cccDNA,每个感染肝细胞核中含3040cps，形成稳定的 cccDNA 池(Minichromosome)当前尚无任何药物能直接作用于cccDNA 抑制HBV复制的药物即使长期应用很难 清除 cccDNA Blackberg J et al.J Hepatology 2000;33(6):992 Komori M et al.J Hepatology 2001
6、;35(6):798 Lewin S et al.Antiviral Research 2002;55:381,佑安医院初步研究,研究目的 通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-的能力，分析慢性乙型肝炎患者、慢性乙型重型肝炎患者及隐性感染者体内特异性T细胞免疫应答的差异和作用。,材料和方法,病例分组慢性乙型肝炎组（CHB）20例慢性乙型重型肝炎组（CSH）10例正常对照组1（N1，隐性HBV感染者）6例正常对照组2（N2，正常献血员）10例,研究方法,合成四条HLA-A2限制的HBV特异CTL抗原表位肽作为刺激抗原。表面抗原蛋白Te28-39（简称
7、Te1）表面抗原蛋白Te183-191（简称Te2）多聚酶蛋白Tp573-581（简称Tp）核心抗原蛋白Tc18-27（简称Tc）采用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术检测抗原表位特异性T细胞的免疫应答功能。,结果1：HLA-A2基因表型检测结果,HLA-A2基因表型检测结果（流式细胞技术直接免疫荧光法）左图为HLA-A2阴性结果，右图为HLA-A2阳性结果,结果2：抗原特异性CTL应答功能检测结果及分析,ELISPOT实验结果图,抗原特异性CTL对肽的反应结果,只要对任何一条肽刺激产生IFN-的阳性斑点者即计为反应阳性者。CHB组，阳性率为50%（10/20）CSH组，阳性率为10%（1/1
8、0）N1组，阳性率为83.3%（5/6）N2组，阳性率为10%（1/10）N1组对肽反应的阳性率显著高于CSH组(P=0.008)和N2组(P=0.008)。,HBV特异性抗原表位肽在组内的应答差异,采用Fishers 确切概率法，组间两两比较，*表示N1组对Tp抗原表位肽、对Te1抗原表位肽和对Tc抗原表位肽反应的阳性率高于CSH组(P0.008)和N2组(P0.008)。,四条肽对不同分组PBMC的刺激作用,各组研究对象对各条肽的应答情况,HBV特异性抗原肽平均反应强度的比较结果,经秩和检验，N1组对四条肽的平均反应强度大于CHB组、CSH组和N2组，P0.01。,HBV隐性感染者特异性免
9、疫应答能力强于CHB组和CSH组，尤其是HBsAg肽在HBV清除后依然可使机体产生很强的细胞免疫反应。这可能是其能够依靠自身免疫功能清除病毒的主要原因。,抗原特异性CTL应答功能结果分析,慢性乙型肝炎患者细胞免疫应答较弱，而慢性乙型重型肝炎患者这种应答反应更是缺乏。表明患者很难依靠自身的免疫能力清除体内感染的病毒。ELISPOT方法体外检测T细胞产生IFN-的能力有可能作为判断机体抗病毒能力的细胞免疫指标。,乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系,研究对象：HLA-A24阳性患者：急性乙型肝炎 7例 慢性乙型肝炎 13例HLA-A24阴性患者：急性乙型肝炎 6
10、例 慢性乙型肝炎 17例PBMC用HLA*2402HBV肽链四聚体复合体染色流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞,ELISPOT技术检测部分患者的CTL细胞分泌IFN-的水平。,范振平等，中华医学杂志,2004,84(24):2073-2076,结果:在7例急性乙型肝炎的急性期,-高水平的HBV特异性的CTL细胞,急性乙型肝炎的恢复期,HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降，13例慢性乙型肝炎患者中,除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外,均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞IFN的分泌。结论：急性肝炎患者中的PBMC中有高水平的HBV特异性CTL细胞,这些细胞可能与控制乙型肝炎病毒的复制及
11、病毒的清除有关。,范振平等，中华医学杂志,2004,84(24):2073-2076,乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能 检测的初步研究,研究目的通过酶联免疫斑点法检测乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能,初步研究各型乙肝患者特异性细胞免疫功能的差异。赫兢，辛绍杰等，中华实验和临床病毒学杂志,2006,20(1):33-35,材料和方法,病例分组（每组4例）急性乙型肝炎组 慢性乙型肝炎组肝炎肝硬化（乙型）乙肝病毒(HBV)既往感染接种乙肝疫苗后血清乙肝病毒学标志中 仅表面抗体阳性及未接种过乙肝疫苗组血清HBV 标志全部阴性者,研究方法：,根据文献报道,设计合成HBV 表面抗原(HBsAg)3 条主要抗原
12、决定簇表位多肽,分别长912 个氨基酸,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测各组研究对象的外周血单个核细胞中-干扰素分泌细胞的数量。,结果,ELISPOT检测各型乙肝患者的SFC 数值,急性乙肝患者、慢性乙肝患者及急性乙肝患者、肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞-干扰素分泌细胞数量明显不同(P=0.0209 及P=0.0211),存在问题,ELISPOT技术:操作步骤多,复杂,难以标准化新鲜细胞和冻存细胞差异HBV研究方面:观察病例少,领域少；没有系统长期的观察研究报道；没有全基因多肽的系统研究。,ELISPOT应用前景,临床迫切需要操作步骤需要简化,建立参照标准操作向自动化改进,NH2,C,
13、S,E,NP,ORF1-11,COOH,M,1,2,4,3,5,6,7,8,9,10,11,12,Overlapping peptides for SARS T cell epitopes,2000,15 aa overlapping by 10 aa,M,E,N,Orf 3,Replicase,Spike,Orf 4,Orf 14,Orf 13,Orf 7,Orf 8,Orf 9,10,11,Distribution of T cell epitopes,%recognition at population level,联系方式,北京右安门外西头条8号北京佑安医院100069010 63296484Email:,谢谢,
