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1、建立新的诊断理念,服务于临床,细菌耐药已成为全球关注的焦点,Enterococcus faecium(屎肠球菌),Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌),Klebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯菌),Acinetobacter baumannii(鲍曼不动杆菌),Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌),Enterobacter species(肠杆菌),Onigman P.MLO Med Lab Obs.2012 Jul;44(7):52-3.2.Qiu LL.Chinese Journal of Misdiagnostics.2011
2、;11(36):8960-1,筛选出耐药菌株MDR、XDR、PDR菌株筛选出真菌菌株、引起二重感染筛选出难辨梭菌、引起抗菌药物腹泻筛选出致病性增加的菌株促进定植以及增加感染菌株致病能力由抗菌药物治疗引起的微生物生态学损害及不良反应：附加损害,抗生素使用不当，与耐药菌医院感染的发生直接相关,David L.Paterson,CID 2004:38(Suppl 4):S341-5,3,zhu_,新的感染特点,感染症状不典型或不明显.未知病原,条件致病或非致病病原引起感染多来势猛死亡率高,微生物室面临多重挑战,面临挑战,日趋严格的管理法规越来越高的临床要求标本数量的剧增和复杂来源有限的人力资源,四川
3、省人民医院（本部）四川省人民医院（草堂病区）,形态学检查 细菌培养鉴定、药敏试验 厌氧菌培养 血清学试验 双相真菌培养、药敏试验 结核分枝杆菌培养 医院感染监测,日平均微生物检验标本700-800份,必须保证微生物检验 结果准确、可靠 流程简化、方便,临床对临床微生物检验服务的需要,如何做?,规范操作:提供正确的检验结果建立有导向性诊断试验,提供早期诊断的依据加快分离和鉴定的速度,尽快提供修正治疗的依据,管理制度规范化,24小时值班、保证周末有足够工作人员 安排专人，微生物标本及时涂片、接种、培养 血液及危重病人的三级报告制度 医院感染多重耐药菌监测报告制度 传染病报告制度 生物安全管理制度,
4、标本采集的规范化制度,2023/3/6,标本采集手册不同部位标本的采集方法合格的标本类型、送检次数、标本量明确规定需要尽快运送的标本合适的运送培养基延迟运送时，标本的保存方法安全运送标本的方法标本标识,标准操作程序,标本收集与处理,试剂处理及配制,各种记录表格,手工项目,质量控制与质量保证,仪器设备,人员培训,管理性文件,建立实验室的SOP,注意各项记录的保存,如何做?,规范操作:提供正确的检验结果建立有导向性诊断试验,提供早期诊断的依据加快分离和鉴定的速度,尽快提供修正治疗的依据,临床希望第一时间知道的信息,感染或非感染细菌感染或非细菌感染酵母样真菌感染或丝状真菌感染白色假丝酵母或其他念珠菌
5、感染曲霉菌感染或毛霉菌感染 因为上述感染治疗方法不同,不同病原感染治疗方案不同,2023/3/6,革兰氏染色 所有微生物检验的开端,自动化染色仪,手工染色,标准、清洁、安全,用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格,不合格标本,合格标本,吞噬现象,伴行现象,可疑致病菌的确认,包裹现象,涂片是最简单的导向性病原学检测方法,氟康唑伏立康唑伊曲康唑两性霉素B,氟康唑两性霉素B5氟胞嘧啶,头孢呋辛头孢曲松青霉素万古霉素,涂片是最简单的导向性病原学检测方法,诺卡氏菌,复方新诺明,青霉素克林霉素,产气荚膜梭菌,卡氏肺孢子菌,涂片是最简单的导向性病原学检测方法,2023/3/6,2010年从病人血液中培养鉴定出
6、马尔尼菲青霉菌,涂片是最简单的导向性病原学检测方法,2023/3/6,2013年从病人骨髓中培养鉴定出链格孢菌,涂片是最简单的导向性病原学检测方法,2023/3/6,开下列培养时,应当同时开革兰染色,CSF或无菌体液眼、脓性渗出伤口组织痰或气管吸取物所有外科标本尿道分泌物（仅男性，细胞内淋球菌）阴道标本,降钙素原（PCT）的临床价值,Chest 1992;101:1644-55,脓毒血症的发展,脓毒血症是一种进行性的疾病!,Systemic Inflammatory Response Syndrome全身炎症反应综合征（满足以下2个或以上条件）体温 38 or 90/min呼吸急促 20min
7、 or HRventilation(CO2 12,000 or 10%未成熟中性白细胞,临床细菌性感染/脓毒血症的挑战,手术后的头号对手：感染 细菌性感染？细菌污染手术后常见的发热，是机体本能的应急反应？还是真正由细菌感染引起的发热临床医生的准确决策 是否启用抗生素？,WBC 白细胞计数Endotoxin 内毒素IL-6 白介素-6IL-10 白介素-10TNF 肿瘤坏死因子Procalcitonin 降钙素原CRP C反应蛋白Protein CHMG-1sTREM-1.,临床常选择的实验室指标,Report of the 5th Toronto Sepsis Roundtable,Toron
8、to,Ontario,Canada,October 25,26,2000.,对脓毒血症的诊断、预后及治疗监测各生物学指标的评估性能,诊断,预后,监测,无论是对脓毒症的诊断、预后评估及治疗监测PCT都体现出最优异的性能,细菌感染严重程度判断,在感染疾病严重程度的发展过程中，PCT随着严重程度的不同（局部感染、脓毒血症、严重脓毒血症、脓毒性休克），呈现由低到高的浓度变化,PCT血中浓度与病程发展呈正相关对于感染程度及器官机能障碍的严重性进行准确的判断,脓毒症中PCT的使用(ICU),*德国重症学会脓毒症诊断指导方针,PCT 2 ng/ml 表明脓毒症或者非常有可能升级为败血性休克,脓毒症中PCT的
9、使用（危重患儿）,0.1,指导抗生素的治疗,细菌感染/脓毒血症治疗效果监测及预后评估,(n=109),F.Stber,University Bonn,Lecture at ISICEM,Brussels 2001,通过PCT不断在体内衰减，反映出抗生素治疗策略的成功,随着患者对抗生素治疗的响应，引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程,腹膜炎患者，差的预后效果,持续升高的PCT水平，提示比较差的预后（程度加重，死亡）,连续的监测PCT血中浓度可以更好的评估患者的预后,细菌感染/脓毒血症治疗效果监测及预后评估,严重外伤导致脓毒血症患者，生存者,PCT呈快速下降趋势，预示着成功的治疗效果（感染控制、
10、存活）,连续的监测PCT血中浓度可以更好的评估患者的预后,细菌感染/脓毒血症治疗效果监测及预后评估,46岁中年女性进入急诊科时主要的临床症状 左小腿局部呈红斑状，无波动感，并且疼痛、肿胀2天，但没有发热、畏寒、咳嗽、咯痰、排尿困难等临床指征，也没有其他基础性疾病病史基础生命指征 BT 37.2 HR97/min RR17/min BP142/91mmHg,临床病例,实验室检查数据,急诊科医师初步诊断：蜂窝性组织炎,一般蜂窝性组织炎主要致病菌是金黄色葡萄球菌，主要引起一些局部的细菌感染，表现出红肿热痛等主要的临床症状,蜂窝性组织炎的治疗策略,急诊科医生立即抽血送检血培养，并马上启动经验性抗生素治
11、疗方案之后转送感染科病房，密切监视患者病情变化患者入院后即开始出现发热等临床症状，并持续了3天，期间还伴随出现了血压过低、休克等危急的临床状态三天后：血培养金黄色葡萄球菌（连送2套，2套均培养出相同菌）继续进行抗生素治疗策略,PCT:4.35 ng/mL,通过PCT浓度的提示，该患者已经发展成为脓毒血症，但其生命体征、临床症状却没有明显的脓毒血症指向.,入院治疗19天后痊愈出院此时复查PCT血清浓度：0.05 ng/ml（已恢复至正常值）,难辨梭菌A/B毒素的检测,难辨梭菌感染全世界面临的新的题,Source:Clostridium diffi cile PCR ribotype 027:as
12、sessing the risks of further worldwide spreadArchie C A Clements,Ricardo J Soares Magalhes,Andrew J Tatem,David L Paterson,Thomas V Riley Lancet Infect Dis 2010;10:39504,美国医院内难辨梭菌的感染率从1996年的31例/10万上升至2003年的61例/10万 2003年加拿大一家医院爆发CDAD共造成189例患者死亡,欧洲也有类似的暴发,2003年欧美大爆发高毒性NAP1/027型出现国内也有散在病例报道，但无流行报道,难辨梭菌
13、感染全世界面临的新问题,2006年美国、法国、英国再次爆发高毒性NAP1/027型,027型和017型是涉及近期医院爆发的主要菌株,1999-2009 欧洲死亡人数明显增加,3年内由MRSA、VRE和 CD引起的院感比例 MRSA下降21%VRE下降41%但CD的比例没有改变在流行暴发时，使用酒精消毒液进行手卫生对CD无效,难辨梭菌如何致病？,抗生素治疗,难辨梭菌暴露&定植,引起腹泻、结肠炎等,扰乱结肠正常菌群环境,释放毒素,难辨梭菌相关性疾病(CDAD)、腹膜炎、败血症 等,死亡,伪膜性肠炎,难辨梭菌相关性疾病（CDAD）,主要的CDAD：-伪膜性肠炎(PMC)-毒性巨结肠-结肠穿孔-脓毒症
14、-罕见的死亡-,难辨梭菌侵袭小肠、结肠，引起的一种急性渗出坏死性炎症，伴伪膜形成现证实主要是由该菌毒素所致。大多数与近期接受抗生素治疗有关,可能诱发CDAD的抗生素,目前普遍认为：任何广谱抗生素的大剂量、长期使用，均有可能引发CDAD,难辨梭菌相关毒素,A毒素-肠毒素，对白细胞有趋化作用，使肠壁出现炎症、渗出、出血及坏死-主要致病因子B毒素-细胞毒素，损害细胞骨架，使细胞团缩坏死，直接损坏肠壁细胞，可导致假膜形成-目前检测金标准 细胞培养中B毒素的细胞毒性活性（CTA）B毒素检测细胞致死肿胀毒素（CDT）-二元毒素，在某些强毒菌株中表达，但其致病机理仍不明确,难辨梭菌检查最主要的临床指征,风险
15、人群-长期使用抗生素的患者-老年患者、免疫缺陷患者、胃部疾病治疗临床指征：(黄绿色)稀便/水样便2天,每天至少排便3次；一般无粘液脓血-发热-食欲下降-恶心、反胃-程度不同的腹痛、腹部压痛-白细胞升高症状可能出现时间：-使用抗生素数天后-停药后8周（约20%病例）,根据ESGCD(欧洲难辨梭菌研究组)推荐的基于毒素A/B检测和难辨梭菌培养的CDAD诊断。,约25%的难辨梭菌菌株是不产生毒素的有可能不是导致腹泻的真正原因,临床症状+抗生素治疗史(4-8周)+年龄65岁,产毒素株培养、毒素检测策略,实验室常规检测临床意义分析,培养阳性+毒素阳性=产毒素的难辨梭菌感染培养阴性+毒素阴性=无难辨梭菌感
16、染/如无其他明确诊断,加送新鲜样本培养阴性+毒素阳性=可用CTA或PCR确认,或再次收集新样本进行培养和毒素检测培养阳性+毒素阴性=需要再次收集新样本检测毒素,或直接采用培养菌落进行毒素检测,毒素检测,毒素检测,培养阴性,新鲜排泄物,筛选平板,培养阳性,300l菌悬液,培养阳性,特殊检测样本培养菌落,3个麦氏浊度菌悬液,5个独立菌落+1ml生理盐水（约3个麦氏浊度菌悬液）,A/B毒素,结合临床的相关实验室检查,血常规：WBC升高GDH（谷氨酸脱氢酶）检测大便常规：类似其他感染性腹泻大便培养分离到难辨梭菌-但不能作为主要诊断依据，只有产毒素的菌株致病粪便滤液细菌毒素测定阳性-敏感性、特异性高，但
17、阴性不能完全排除纤维结肠镜发现伪膜金标准细胞培养毒素B的细胞毒性作用PCR基因检测其他：-腹部平片、CT：非特异性改变，除非并发穿孔、巨结肠等-钡灌肠：非特异性改变，有引起穿孔危险,真菌快速检测对临床的诊断价值,可检测多种真菌感染，敏感度62%100%，特异度64%100%念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌、毛孢子菌等不能检测：隐球菌和接合菌阳性结果代表存在侵袭性真菌感染，阳性早于血培养阳性和临床症状出现真菌对数生长期释放量最大，可被体内葡萄糖酶降解推荐动态监测，每周检测2次,D葡聚糖（G试验）的价值,曲霉菌半乳甘露聚（GM）,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原可以从血清、脑脊液、胸
18、水、BALF检测到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/mlLatex agglutination：15ng/ml,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,可能成为替代检查，可用于早期诊断和治疗监测可以在CSF和支气管肺泡灌洗液中检测结合临床和影像学表现来决定临床疗程建议：GM实验+CT可以作为早期诊断侵袭性曲霉病的依据。,2023/3/6,真菌血清学抗原及PCR检测比较,GM G PCR 曲霉菌属+镰刀霉菌-+接合菌纲-+念珠菌属-+隐球菌属+-+青霉菌+拟青霉菌+,快速分离、快速鉴定、快速报告！及时修正错误的初始治疗,胶乳凝集试验,肺炎链球菌乳胶凝集试验-溶血链球菌乳胶凝集试验 MRSA
19、乳胶凝集试验 隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验,SLIDEX STREPTO GROUPING KIT,革兰+阳性（G+）触酶（H2O2）-,Slidex Strepto KIT,Strepto A,Strepto B,Strepto C,Strepto D,Strepto F,Strepto G,胶乳凝集试验,阳性凝集 阴性(positive)(Negitive),MRSA胶乳凝集试验,隐球菌乳胶凝集试验,阴性,阳性,胶乳凝集试验,标本为脑脊液或血清；操作简便、快速，可用于隐球菌感染的早期诊断 灵敏度和特异性均在95%以上，有估计预后和疗效的作用。,隐球菌胶乳凝集试验,显色培养基的应用,Chr
20、omID ESBL鉴定分离超广谱-内酰胺酶Chrom Id Candida分离鉴定念珠菌ChromID MRSA 鉴定分离耐甲氧西林金葡菌ChromID VRE 鉴定分离万古霉素耐药的肠球菌,显色培养基的应用,多重耐药菌主动筛查与去污染（尤其是ICU病人）鼻拭子 MRSA肛拭子 ESBLs VRE 鲍曼不动杆菌 铜绿假单胞菌,2023/3/6,产超广谱酶:大肠：红色;肺炎克雷伯 菌：绿色;变形杆菌:棕色,显色培养基的应用,MRSA:绿色,VRE粪肠球菌:紫色 屎肠球菌:蓝绿色,显色培养基的应用,白色念珠菌:蓝绿色,显色培养基的应用,ID32C 酵母鉴定系统,APIAUX酵母鉴定系统,如何做?,
21、规范操作:提供正确的检验结果建立有导向性诊断试验,提供早期诊断的依据加快分离和鉴定的速度,尽快提供修正治疗的依据,微生物检测的治疗价值被忽视,2023/3/6,三级综合医院评审标准对微生物要求,2023/3/6,2023/3/6,渐进式的微生物实验室自动化,血培养,菌血症诊断金标准培养瓶肉汤培养能力；仪器侦测微生物阳性生长的能力；操作的简便、自动化和连线报警；方便夜班和24小时处理，时间节点记录；生物安全；,报警时间48h 98 72h 99,天,株数,第三代血培养系统的速度,自动化鉴定药敏分析仪,简单、准确、快速数据自动、多角度审核；个性化设置方案；及时升级；数据导出与分析；,80%临床分离
22、株鉴定:平均检测时间=5 小时 苛养菌鉴定时间6小时鉴定+药敏:平均检测时间=68 小时,快速鉴定、快速药敏,现在，我们有机会为大部分临床医生提供48小时快速报告！,快速鉴定、快速药敏,08:0008:30,08:00,17:00,17:30,16:00,引进质谱技术,2023/3/6,突破微生物报告时间的瓶颈16-24小时分级报告,实验方法与感染的鉴别密切结合筛选性方法和传统方法相结合简单的常规方法与分子生物学方法相结合,未来实验室诊断理念,非特异性PCT诱因-可能的假阳性结果包括:手术创伤、多处创伤：在手术后的前两天出生48小时以內的新生儿免疫刺激药物(OKT3,TNFa,IL-2.)严重烧伤血液透析中暑,PCT略微增加感染早期(6-12 小時后重新检测!)之前进行过有效的抗生素治疗非典型性肺炎(肺炎支原体、肺炎衣原体)局部感染(肾炎),PCT检测的局限性,对PCT检测的影响,受以下因素影响*甲状腺功能 是功能性甲状腺髓样癌的肿瘤标志物*肾功能 严重肾功能受损者中水平较高不受以下因素影响*类固醇药物*自身免疫性疾病*年龄、性別*免疫功能低下状态:肝硬化、HIV感染,
