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1、实验六、PCR扩增技术（8学时）,1.Taq 酶的特点和作用原理2.PCR 体系的组成及其作用3.PCR特异引物的设计4.PCR 仪器的使用5.PCR 反应的设置6.PCR 结果的电泳检测,时间安排,1、介绍PCR扩增技术的原理 2、转化子的菌落PCR筛选（此两步共4学时）3、PCR 结果的电泳检测 4、转化子的酶切鉴定（此两步共4学时）,PCR的定义：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。,PCR的技术特点：特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等,Kary B.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DN
2、A引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9
3、月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polyme
4、rase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR技术原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。分为三个基本步骤：模板DNA变性：加热至94左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：将温度降至引物的Tm值以下，3端与5端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域通过氢键配对结合；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性-退火-
5、延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。,PCR的原理,标准PCR反应体系,10扩增缓冲液 10l 4种dNTP混合物 各200mol/L 引物 10100 pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5 u（Mg2+）1.5 mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,PCR反应五要素,引物（primer）酶（Taq DNA polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）,引物,引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度引物包括正向（F）和反向（R）引物,引物设计
6、的原则,1、引物长度：16-30个碱基，常为20个碱基左右。2、引物碱基组成：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布，尤其在3端不应存在连续3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补，而影响PCR的特异性。可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm4(G+C)+2(A+T)。,4、避免引物内或引物间出现二级结构或引物间互补 避免两引物间互补，特别是 3端5、引物 3端的碱基要求严格配对引物3端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3端A影响最大，因此，尽量避免在引物3端第一位碱基是A。引物3端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并
7、性而影响扩增特异性。6、引物5端对扩增特异性影响不大,引物中可以加上合适的酶切位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等 7、引物的特异性所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。8、两引物的Tm值接近9、简并引物应选用简并程度低的密码子例如选用只有一种密码子的Met,3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。,dNTP 的质量与浓度,dNTP使用注意：1)保存：使用时应配成高浓度（5-10 mmol/L），小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；2)使用量：在PC
8、R反应中，dNTP终浓度应为20-200umol/L。3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等；,Mg2+的浓度,1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大 Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。2）通常Mg2+浓度范围为0.5-2 mmol/L。,模板,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。,Taq DNA聚合酶,有很高的耐热稳定性。一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min,95 40 min，97 5min。Taq DNA聚合酶的酶活性单位
9、定义为74下30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。在100 l PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。纯化的Taq酶在体外无3-5外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。一般PCR中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环。应用低浓度的dNTP(各20 molL)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10-6次/每轮循环。,高保真的DNA聚合酶,通常所用的PCR方法在两个方面都有局限性，扩增片段的精确程度和合成片段的大小。Pfu DNA聚合酶是一种热稳定性
10、DNA 聚合酶，从携带pyrococcus furiosus 的 pol 基因的大肠杆菌中分离得到。该酶具有 3 到 5 校读外切酶活性，其最适反应温度为 75，并且错误率极低（大约是 Taq DNA 聚合酶的 8 倍）。Pfu 是目前保真度较高的聚合酶。PrimeSTAR DNA聚合酶是兼具高保真性和高扩增效率的DNA 聚合酶。该酶具有 3 到 5 校读外切酶活性。制品中添加了能在常温状态下抑制聚合酶和外切酶活性的抗体，能有效防止PCR反应前的引物错配和引物降解。,灭活Taq DNA聚合酶的方法,(1)PCR产物经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀。(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(
11、3)99-100加热10 min。(4)目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。,反应缓冲液,反应缓冲液一般含10-50 mmol/L TrisCl(20下pH8.3-8.8),50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+，TrisCl在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8、50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。,PCR反应
12、参数的设置,温度 时间 循环次数,设置温度与时间,设置变性-退火-延伸三个温度点：标准反应中采用三温度点法：1）93-95变性；2）40-60退火；3）70-75延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性的温度与时间,在94下预变性2-5 min非常重要，它可使模板DNA完全解链。一般变性温度与时间为94 1min。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡或PCR仪器设置成热盖。,退火的温度与时间,引物退火的温度和所需时间的
13、长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。退火温度越高,所得产物的特异性越高。而退火温度过低，易引起非特异性扩增。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。退火反应时间一般为1 min。,延伸的温度与时间,温度：一般7075，常用温度为72。时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够了。延伸时间过长会导致产物非特异性增加，但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得
14、尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环次数,当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。通常经25-30轮循环扩增后,反应中Taq DNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增。,PCR产物的克隆,在许多研究中，需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。平末
15、端连接 由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3端加上多余的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。在PCR产物尾部加dT或ddT Taq DNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A，目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3-T的T-Vector。粘性末端连接 利用引物中附加在5端的限制酶位点，直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接，产生重组DNA。如果上下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。,PCR常见问题1
16、,无扩增产物：阳性对照有条带，而样品则无原因：1、模板含有抑制物，含量低2、引物设计不当或者发生降解3、退火温度太高，延伸时间太短,PCR常见问题2,非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多,PCR常见问题3,假阳性：空白对照出现目的条带。原因：1、靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。3、各种试剂先进行分装，低
17、温贮存。,菌落PCR,菌落PCR：是直接以转化菌的单个克隆为模板，通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。与传统的鉴定方法相比，由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选。,菌落PCR,材料、设备及试剂,材料 菌落来源的模板DNA设备 移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。试剂1、Taq 酶(Biotech)。2、引物1和2：10 mol/L。3、dNTP,操作步骤,注意事项：1.PCR非常灵敏,操作应尽可能在无菌操作台中进行。2.吸头、离心
18、管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂。3.加试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。4.应设含除模板DNA外所有其它成分的阴性对照和阳性对照。,操作步骤 I,一、菌落PCR反应要求：设置一个阴性反应，设置一个阳性反应，用四个菌落来源的 DNA作为模板进行转化子的鉴定。1.配制总的PCR反应液25 l 的反应体系依次混匀下列试剂20.5 l ddH2O2.5 l 10 Buffer0.5 l 上游引物（引物）0.5 l 下游引物（引物）0.5 l dNTP0.5 l Taq酶混匀后在离心机上离心5秒2.将PCR反应液分装到各个PCR管
19、（25 l/每管）3.加入模板在无菌操作台中进行,操作步骤 I,一、菌落PCR反应4.在DNA扩增仪上进行反应反应循环：94 预变性2分钟94 变性45秒54 退火45秒72 延伸40秒72 延伸10分钟,29个循环,操作步骤 II,二、扩增转化子以下操作在无菌操作台中进行在灭过菌的试管中加入5ml左右的LB液体培养基（加入Amp+）用无菌牙签挑取一个白色单菌落接种于上述液体培养基中，37下振荡培养12小时左右。,作业,思考题请设计扩增以下基因的引物，并给出PCR反应的参数。5GTAGATGGACTTATGCCGTCCCGGTGACTCCTGGAATAATCGTCCATCCACTCTAAATCAGTTACGGCCTTATCCGCAGGAGTTGAAGTACAAAGGATGTATGATTCGAGGCTTACGGAGTAGAGATGTTCATTTTTCCAGCTTTCAATGGTCTCATGACACATGAGGGACTCGATGGGAAACTCAGGTGTGTAAGTGCTAACTGGGTCTGGGAATAGATGGCGTGCAGTGTAGTCGAAGTC3,
