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1、基于单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测技术的研究,2,Contents,副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3,3,第一章 研究背景及立论依据,1、形态：弧状或短杆状，有鞭毛2、染色性：革兰氏阴性菌3、培养特性：营养要求不高，嗜盐，在含有3.5%的NaCl培养基中生长良好，pH 7.0-9.5，TCBS培养基上易生长。4、生化反应：氧化酶阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖，不发酵乳糖、蔗糖；吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均阳性。,1.1 弧菌生物学性状,4,第一章 研究背景及立论依据,1.2 研究背景及立论依据,弧菌,哈维氏弧菌,人畜共患病原菌,引起鱼体表出血性溃疡，食欲不振，严重时鳞片脱
2、落，烂鳍，眼内出血或变浑浊，肝肾等内脏出血，肠道发炎充血。也可感染虾和贝类。,鳗弧菌,溶藻弧菌,创伤弧菌,副溶血弧菌,引起人类胃肠炎、伤口感染和原发性败血症。,5,第一章 研究背景及立论依据,筛选、克隆、表达和纯化制备多元弧菌高同源性外膜蛋白,制备抗r-Omp多克隆抗体，并进行特性分析,取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞，进行细胞融合,筛选分泌抗多元弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，体内法生产单抗,建立基于单抗的多元 弧菌免疫学检测方法,免疫BALB/c小鼠,1.3 技术路线,6,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,外膜是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构，它位于细胞壁的最外层，厚810 nm，
3、约占细胞壁干重的80%，通常由磷脂、若干种外膜蛋白(Omp)和脂多糖(LPS)组成。,2.1 革兰氏阴性菌外膜的结构,7,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,2.2 多元弧菌OmpK蛋白质序列比对,对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpK蛋白质序列进行多重序列比对分析，在不同弧菌种内OmpK蛋白质序列的平均一致性（Identity）分别为：溶藻弧菌85%，副溶血弧菌78%，哈维氏弧菌78%，创伤弧菌85.3%。不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpK
4、蛋白质序列的平均一致性分别为76.5%、81.6%、79.8%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性78.1%、72.5%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性79.9%。,图2-1 四种弧菌OmpK蛋白质序列比对图,8,2.3 多元弧菌OmpU蛋白质序列比对,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,通过对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、2株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpU蛋白质序列比对分析发现，在不同弧菌种内OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌70.3%，
5、副溶血弧菌96.5%，哈维氏弧菌85%，创伤弧菌89.3%。不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为75.7%、71.7%、67%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为82%、75.4%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性为70.8%。,图2-2 四种弧菌OmpU蛋白质序列比对图,9,2.4 多元弧菌OmpW蛋白质序列比对,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（Vh）的Omp
6、W蛋白质序列比对分析发现，不同弧菌种内OmpW蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈维氏弧菌95.3%。不同种弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%。,图2-3 三种弧菌OmpW蛋白质序列比对图,10,2.5 三种蛋白在多元弧菌种内、种间的平均一致性比较（%）,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,综合比较多种弧菌种内、种间的三种外膜蛋白OmpK、OmpU和OmpW的序列一致性，OmpW蛋白质在溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌种内的序列一致
7、性高于其他两种外膜蛋白；而在不同弧菌种间，溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%，均高于OmpK和OmpU在该三种弧菌种间的一致性。以上分析结果表明，OmpW是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌三种弧菌的高度保守外膜蛋白，是作为三种弧菌的共同菌体表面抗原的较优选择。,11,2.6 与Vp RIMD 2210633的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,在NCBI网站中，使用protein blast程序，在NCBI nr Database中搜索与
8、副溶血弧菌标准株Vibrio parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌菌株。,12,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,图2-4 副溶血弧菌与大肠杆菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:E.coli IAI39的OmpW蛋白质序列,图2-5 副溶血弧菌与痢疾志贺菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:C.Shigella dysenteria
9、e Sd197的OmpW蛋白质序列,图2-6 副溶血弧菌与嗜水气单胞菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila ATCC 7966的OmpW蛋白质序列；,图2-7 副溶血弧菌与syringae假单胞菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:Pseudomonas syringae pv.tomato NCPPB 1108的OmpW蛋白质序列
10、,13,多元弧菌种内和种间OmpW蛋白质序列的高度保守性,弧菌和非弧菌OmpW蛋白质序列的较大差异性,单克隆抗体本身具有的识别单一抗原决定簇、特异性强的优良特性,为后续工作筛选到可特异性识别多元弧菌、而与非弧菌无交叉反应的抗OmpW单克隆抗体建立了理论基础,第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析,14,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,15,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.2 ompW基因的克隆,图3-1 副溶血弧菌目的基因ompW的PCR产物电泳图1.DNA marker；2,3,4.Vp 1.1997、Vp 86和Vp 87的ompW基因扩增产物.,以提取的
11、副溶血弧菌Vp 1.1997，Vp 86，Vp 87基因组DNA为模板，分别扩增OmpW成熟蛋白的编码基因序列。将PCR产物分别上样1%琼脂糖凝胶，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察扩增后的产物，结果显示三株菌株对应的泳道均出现了约600bp的特异性扩增条带。,16,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.3 重组质粒的构建及鉴定,图3-2 重组质粒的PCR产物及双酶切产物电泳图1.DNA marker;2.重组pET28a-ompW质粒的PCR产物；3.重组pET28a-ompW质粒的双酶切产物；4.pET28a质粒双酶切产物；5.DNA marker,3.3.1 重组质粒的PCR和双
12、酶切验证:,分别双酶切pET28a载体和PCR产物，将二者进行酶连，连接产物转化感受态BL21(DE3)。提取重组菌的质粒经PCR反应后，扩增出约600bp的目的片段。提取的质粒经双酶切反应后，电泳图显示出现约5500bp和约600bp的目的片段；pET28a原始质粒双酶切后，仅出现约5500bp的片段。上述结果初步证实重组质粒已构建成功。,17,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.3.2 重组质粒的测序鉴定:,图3-3 副溶血弧菌Vp 1.1997与Vp RIMD 2210633 ompW基因序列的比对图Query:Vp 1.1997的ompW基因序列；Sbjct:V.parah
13、aemolyticus RIMD 221063的ompW基因序列,图3-4 副溶血弧菌Vp 1.1997与Vp RIMD 2210633 OmpW成熟蛋白序列的比对图Query:Vp 1.1997的OmpW成熟蛋白序列；Sbjct:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW成熟蛋白序列,18,第三章 副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达,3.4 重组蛋白r-OmpW的诱导表达与纯化,图3-5 不同菌体裂解后产物的电泳图1.蛋白marker;2.含pET28a原始质粒且未经IPTG诱导的菌体裂解产物;3.含pET28a原始质粒且经IPTG诱导的菌体裂解产物;4.含pET
14、28a-ompW重组质粒且未经IPTG诱导的菌体裂解产物;5.含pET28a-ompW重组质粒且经IPTG诱导的菌体裂解产物.,图3-6 重组蛋白的表达形式及纯化电泳图1.protein marker;2.重组菌裂解液离心后的沉淀；3.重组菌裂解液离心后的上清液；4.纯化的重组蛋白,在IPTG诱导下，重组大肠杆菌大量表达出预期分子量(27kDa)的重组蛋白，重组蛋白以包涵体的形式存在。经镍柱Ni-IDA亲和层析法纯化，重组蛋白达到电泳纯。,19,第四章 抗OmpW多克隆抗体的制备与特性分析,4.1 重组蛋白浓度测定,4.2 小鼠免疫及效价测定,以1 mg/mL BSA标准蛋白溶液稀释至不同浓度
15、，分别加入考马斯亮蓝染液反应。根据标准蛋白BSA的含量与对应A595吸光度绘制Bradford标准曲线，得标准曲线方程为：y=0.045x（R2=0.976）。其中，y为595 nm处吸光度，x为蛋白含量。经透析后，重组蛋白浓度为0.636 mg/mL。,取纯化透析后的重组蛋白，对BALB/c小鼠进行免疫。三免后第7天断尾采血，分离血清。间接ELISA法测定血清中抗体效价，包被抗原为甲醛灭活的副溶血弧菌全菌。经测定，三免后抗体效价达到1:5.4104。抗重组蛋白血清识别副溶血弧菌全菌，表明重组蛋白r-OmpW与天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性。,图4-1 Bradford标准曲线,20,第
16、四章 抗OmpW多克隆抗体的制备与特性分析,图4-3 抗副溶血弧菌全菌血清与r-OmpW的免疫印迹 1.预染的蛋白marker；2.鼠抗副溶血弧菌血清与r-OmpW反应.,图4-2 抗r-OmpW血清与r-OmpW的免疫印迹 1.预染的蛋白marker；2.鼠抗r-OmpW血清与r-OmpW反应.,4.3 免疫印迹试验,重组蛋白r-OmpW具有良好的免疫原性,重组蛋白r-OmpW与天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性,21,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,图5-1 单克隆抗体的制备过程,22,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.1 细胞融合与克隆化,图5-2 杂交瘤
17、细胞生长状态,将小鼠的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合后，重悬于HAT培养液，接种于5块96孔板。约8d后进行观察，有杂交瘤细胞生长的孔数为217孔，占45.2%；融合后第10d-12d，使用间接ELISA法对分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞进行初筛，包被抗原为灭活的副溶血弧菌。其中阳性融合孔为24孔，阳性率为11.1%。选择A值较大的三株阳性细胞株通过有限稀释法进行克隆化，直至克隆板阳性率达到100，建株保种。三株杂交瘤细胞分别命名为：S1E6，S4E10，S5C10。,23,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.2 杂交瘤细胞株培养上清液mAb效价测定,5.3 mAb免疫球蛋白亚
18、类鉴定,三株杂交瘤细胞株培养上清液mAb效价在1:500-1:100之间。,使用间接ELISA方法测定三种杂交瘤细胞分泌的mAb免疫球蛋白亚级分类，结果表明，mAb(S1E6)属IgG2b，mAb(S4E10)属IgG2a，mAb(S5C10)属IgG3。,24,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.4 杂交瘤细胞株的复筛,表5-3 mAb识别多元弧菌的广谱性分析,杂交瘤细胞株S4E10分泌的mAb对副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌有阳性反应，与哈维氏弧菌、鳗弧菌呈阴性反应；而杂交瘤细胞株S1E6、S5C10分泌的的mAb与5种不同弧菌均有阳性反应，所以后续试验采用杂交瘤细胞株S1E
19、6和S5C10制备腹水mAb，并进行效价和特异性分析。,注：V.parahaemolyticus.为副溶血弧菌，V.alginolyticus.为溶藻弧菌，V.harveyi.为哈维氏弧菌，V.vulnificus.为创伤弧菌，V.anguillarum为鳗弧菌；,25,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.5 腹水mAb效价测定,表5-4 腹水mAb效价,分别培养两株杂交瘤细胞株S1E6和S5C10至对数生长期，将BALB/c成年鼠注射1106个杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨胀抽取腹水，离心后收集上层腹水，使用间接ELISA方法测定其抗体效价。细胞株S1E6和S5C10分泌的腹水m
20、Ab效价分别达到1:1104，1:4.6104。,26,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.6 腹水mAb特异性分析,mAb(S1E6)不仅与5种弧菌均有阳性反应，而且与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、痢疾志贺菌也有交叉反应。mAb(S5C10)与5种弧菌均有阳性反应，与9种非弧菌无交叉反应，为后续试验建立基于单克隆抗体的特异性检测多元弧菌的方法提供了物质基础。,表5-5 腹水mAb的特异性试验,注：V.parahaemolyticus.为副溶血弧菌，V.alginolyticus.为溶藻弧菌，V.harveyi.为哈维氏弧菌，V.vulnifi
21、cus.为创伤弧菌，V.anguillarum为鳗弧菌；,27,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.7 杂交瘤细胞mAb分泌稳定性,表5-6 杂交瘤细胞S5C10分泌mAb稳定性,分别测定杂交瘤细胞S5C10扩培后的第3天、连续传10代、连续传20代、冻存30d后复苏的杂交瘤细胞培养上清液抗体效价。结果表明，除刚复苏的杂交瘤细胞分泌抗体的能力有所下降外，杂交瘤细胞株S5C10连续传代培养的细胞上清液的效价与原代细胞基本一致，证明杂交瘤细胞S5C10具有较稳定的分泌抗体的能力。,28,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,图5-3 mAb(S5C10)与重组蛋白的免疫印迹图
22、1.预染的蛋白marker；2.mAb(S5C10)与重组蛋白的反应;,5.8 腹水mAb与r-OmpW的免疫印迹,将重组蛋白进行SDS-PAGE后，电转至PVDF膜，并与腹水mAb(S5C10)和二抗依次反应后，进行显色，见图5-3。结果显示，在约27kDa处出现了颜色反应，表明杂交瘤细胞株S5C10分泌mAb可识别重组蛋白r-OmpW。,29,第五章 抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析,5.9 腹水mAb的纯化,图5-4 纯化后mAb(S5C10)的电泳图1.蛋白marker；2.纯化的IgG,杂交瘤细胞株S5C10分泌的腹水mAb经rProtein A Sepharose亲和层析纯化和
23、分离后，进行SDS-PAGE分析。结果显示，纯化后的单克隆抗体有两条带，一条带为IgG的重链，分子量约55 kDa左右，另一条为轻链，分子量约26 kDa左右。,30,第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立,6.1 mAb反应浓度的优化,当mAb终浓度在2.520g/mL时，细胞染色率随着抗体浓度的增加而增大，当mAb浓度增加到20g/mL时，细胞染色率达到96.8%。mAb增加到40g/mL时，细胞染色率增加不显著。因此，采用mAb终浓度20 g/mL进行后续的实验。,6.2 mAb反应时间的优化,当mAb反应时间在1545min时，细胞染色率随着染色时间的增加而增大，当染色时间为45 m
24、in时，细胞染色率达到95.7%。在45min75min，随着时间的增加，细胞染色率增加不显著。为确保反应充分，本实验采用mAb的反应时间为60 min。,在mAb的优化使用条件下，即取1ml副溶血弧菌（5105 cells/mL），加入mAb至终浓度20 g/mL，反应60 min，洗涤后，加入过量二抗反应30min，洗涤后，进样流式细胞仪分析，细胞染色率达到97.1%。,图6-1 mAb反应浓度的优化,图6-2 mAb反应时间的优化,31,第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立,6.3 流式细胞术检测弧菌的准确性与检出限,对菌体浓度在104107 cells/mL内的样品2样品5的检测结
25、果表明，流式细胞术与平皿菌落计数法的检测结果显著相关(P0.01)，相关系数r=0.9920，检测值可信度较高。对于浓度低于104 cells/mL的样品1，两种方法的检测结果有较大偏差(80.7%)。FCM法检测弧菌的最低检出限为104cells/mL。,图6-4 FCM检测值与平皿菌落计数值的对比图流式细胞术；平皿菌落计数,32,第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立,6.4 流式细胞术检测弧菌的特异性,图6-5 FCM检测多元弧菌的荧光信息直方图,33,第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立,FCM方法可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而
26、与6种海水中常见非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌）无交叉反应，显示出该方法具有良好的特异性。,图6-6 FCM检测非弧菌的荧光信息直方图,34,第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立,6.5 流式细胞术检测弧菌的精密度,表6-2 精密度试验,对1号（5104 cells/mL）、2号（5105 cells/mL）样品每天进行一次FCM分析，每次做三个平行，一共测试5天，结果分析见表6-2。每个浓度下的变异系数均小于7%，变异较小，表明该方法具有较好的精密度。,35,结论,对溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌的OmpW蛋白质序列进行序列比对分
27、析表明，不同弧菌种内OmpW蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈维氏弧菌95.3%。在不同种弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为89%。生物信息学分析表明，OmpW是多种弧菌种内、种间高度保守的外膜蛋白，可作为多种弧菌共同的菌体表面抗原。以提取的副溶血弧菌标准株V.parahaemolyticus 1.1997基因组DNA为模板，成功克隆到OmpW成熟蛋白的编码基因序列，并构建了pET28a-ompW重组质粒，转化大肠杆菌E.coli BL21。在
28、IPTG诱导下，导入pET28a-ompW重组质粒的重组菌E.coli BL21大量表达了预期分子量（27kDa）的重组蛋白。通过镍柱Ni-IDA纯化，重组蛋白r-OmpW达到电泳纯。,36,结论,分别将重组蛋白r-OmpW和甲醛灭活的副溶血弧菌全菌免疫小鼠，制备抗血清。抗重组蛋白r-OmpW血清在免疫印迹中识别了重组蛋白，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。抗r-OmpW血清识别副溶血弧菌全菌与抗副溶血弧菌全菌血清识别r-OmpW两个实验的结果表明，重组蛋白r-OmpW和天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性，能在机体内激发相似的免疫反应。将r-OmpW免疫后的BALB/c小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓
29、瘤细胞Sp2/0进行细胞融合。将副溶血弧菌作为包被抗原，使用间接ELSIA方法对杂交瘤细胞进行初筛。分别使用5种病原弧菌作为包被抗原对初筛得到的杂交瘤细胞进行复筛，获得杂交瘤细胞株S5C10。杂交瘤细胞株S5C10具有良好的抗体分泌稳定性，其分泌的单抗免疫球蛋白的亚类属IgG3，腹水单抗效价达到1:4.6104，可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而与9种非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌）无交叉反应，表现出良好的特异性。,37,结论,建立了基于单克隆抗体的多
30、元弧菌流式细胞术检测方法，优化了一抗（单抗）的反应浓度和时间，并对该方法进行了初步评价。该方法检测过程需2h左右，当菌浓在104107cells/mL范围时，FCM法检测值可信度较高；可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而与海水中常见的6种非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌）无交叉反应；对含不同菌体浓度的样品进行重复检测，变异系数CV值均在7%以内。本方法操作简单，耗时较短，特异性高，具有较好的准确性和稳定性，为多元病原弧菌的检测提供了新的方法。,38,创新之处,以重组蛋白r-OmpW为小鼠的免疫抗原，制备并筛选可识别多种病原弧菌的单克隆抗体，未见相关报道。建立了基于抗OmpW单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测方法，未见相关报道。,
