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1、HPLC(High Performance Liquid Chromatography)高效液相色谱法是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段,什么是高效液相色谱(HPLC)？,液相色谱分析法,（一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。3、
2、废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。（二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。,操作过程图示,色谱分离的机理,分离是一个物理的过程。,固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)样品(溶解于流动相中的溶质),HPLC的特点,高效液相色谱仪构造,HPLC
3、的仪器配置及流程,检测器简介（一）,紫外吸收检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）。折光指数检测器（RID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g）。,检测器简介（二）,电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物
4、。荧光检测器（FLD）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。,检测器简介（三）,蒸发光散射检测器（ELSD）原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。,紫外吸收检测器有三种类型固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254
5、nm或280nm紫外光。可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器photodiodearray detector（PDAD，PDA,DAD）：钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。PDA 可以辅助定性。,液相色谱分析法的特点,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。兼具分离和分析功能，可以在线检测。,高效液相色谱法的主要类型及原理,1、液-液分配色谱2、液-固吸附色谱3、离子交换色谱4、离子对色谱5、离子色谱6、排阻色谱7、亲和色谱(AC),液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本
6、原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。,正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占6070。,液相色谱类型,色谱柱简介,正相柱-固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能
7、团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。,流动相
8、,反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O甲醇乙腈乙醇 丙醇异丙醇四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇,液相色谱图相关术语(1),色谱图相关术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离,HPLC的图形结果-
9、色谱图(Chromatogram),色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.,色谱峰,时间(分),基线,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语(2),色谱图相关术语:峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响 应值标准偏差()(Standard Error):0.607倍峰高处所 对应峰宽的一半拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰,拖尾,前伸,A B,1/10h,h,液相色谱
10、图相关术语(3),色谱图相关术语:基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动,保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰 最大值所需的时间,流动相的选择原则,样品易溶，且溶解度尽可能大。化学性质稳定，不损坏柱子。不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。粘度低，流动性好。易于从其中回收样品。无毒或低毒，易于操作。易于制成高纯度，即色谱纯。废液易处理，不污染环境,提高柱效的方法,固定相填料要均一，颗
11、粒细，装填均匀流动相粘度低低流速升高柱温。,评价液相色谱方法的标准,，k，N如何控制分离度?,K是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。a 是分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，是化学因素。N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质,在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。,确定最佳的溶剂强度,“试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶剂强度以增加k，当所有谱峰的k介于120时，其流动相已经接近最佳了。采用梯度洗脱的实验方法，即在20min内，高强度的溶剂的比例从5
12、%增加到100%，找出在梯度洗脱期间，流出峰到达中点的时间tx(即流出的第一谱峰与最末谱峰之间的中心点)，然后用下式计算合适的流动相离开梯度混合器的时间tk=tx-2t0-tD.t0为死时间，tD为溶剂由梯度混合器流出，通过泵和所连管线到达柱子的时间 最佳溶剂强度时溶剂浓度%：=初始浓度（%）+tk/20最终浓度-初始浓度,柱类型与温度选择性的关系,.柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。温度的选择性，温度的变化会影响分离度。,色谱柱条件,流速适中，过高会降低塔板数。当流动相粘度增加时，塔板数会降低，对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。
13、,其他因素,工作压力：低于150bar操作时间：应尽可能短峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好,液相色谱贮液器的使用及维护,常用干净的无水甲醇试剂瓶作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但瓶盖与导管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器，即沉子，孔径为10m，其作用是：防止灰尘进入泵缸。作为进液导管的重物，使导管能沉在并底。溶剂过滤：常用0.5m膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用0.2m膜过滤。贮液瓶要不定期更换，要有23个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必
14、须用0.5m膜过滤。,溶剂脱气,脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需要脱气。He氦气脱气：10min可以除去8090溶入的气体，但价格昂贵真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。超声脱气：使用方便，但只能脱气30加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用,流动相不畅的原因,原因 管路阻塞 长了霉菌 管道有大量气泡造成空化 贮液并盖子太紧,解决方法更换管路用稀硝酸洗去管内微生物（洗前必须洗净醇类）采用色谱的空灌注和湿灌注抬高贮液并或向并内加压去掉沉子,色谱柱使用及维护（一）,在使用前一定要注意看使用说明，了解柱子的使用范围如pH值等，一般来说，硅
15、胶基质：pH 2.57.0，聚合物填料：pH 113。极端pH的流动相能溶解硅胶。温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3m柱，40；5m柱，70。柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器，若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去23mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降4060）。使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）避免流动相组成及极性的剧烈变化压力升高是需要更换预柱的信号,色谱柱使用及
16、维护（二）用高质量溶剂和水作流动相。流动相脱气每天结束时，先用水洗，再用甲醇洗。若用过缓冲液：必须先水洗3060min 1ml/min），再甲醇洗30min，千万不可先用甲醇冲洗，否则无机盐沉淀堵了管路分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质，建议用90甲醇冲洗3060min；若分析用流动相中含以上物质，要先用10甲醇（或用与分析用流动相同比例，把含酸、碱、盐溶液换成水）冲洗1小时左右，再梯度走到90甲醇冲洗3060min（若用多元泵）。有必要时再循环几次，可以适当缩短时间。若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。及时换密封圈防止色谱柱堵塞的问题1：溶剂中的不溶物应使用色谱纯溶剂，膜过
17、滤（孔径不超过0.45m）2：样品中的不溶物应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45m）3：柱内不溶物的形成：由于溶剂的不互溶而产生的沉淀用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱；在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀检查样品液和流动相是否互溶；由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀将色谱柱密封紧，并保持室温恒定！。,色谱峰保留时间问题:保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱峰保留时间问题:保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶
18、剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏,色谱图常见问题分析,色谱图常见问题分析,色谱峰保留时间问题:保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化；柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确,液相色谱定量分析的基本原理,在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量液相色谱法定量的依据是:被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比由已知量的标样可求得定量校正因子定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其
19、物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量,液相色谱定量分析的基本步骤,开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5 确定被测组分色谱峰的一致性 确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围用不同浓度的标准样品建立校正曲线考查定量方法的准确度及精密度,鉴别需定量的色谱峰(定性),定性鉴别每个要定量的色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用与标样比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份,进一步的确认(定性),标准加
20、入同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）其他检测器PDA，光谱图比较、谱库检索MS，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法,HPLC定量分析的常用术语(2),积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程 定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色 谱峰的S/N10:1校正曲线(Calibration Curve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量,常用的定量方法,标准曲线法,分为外标法和内标法:外标法在液相色谱中用得最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用得最多,外标法定量（一）,配制一系列已知浓度的标样,外标法定
21、量（二）,采集不同浓度 标样的色谱图积分,按外标法 定量计算,建立 标准曲线,标准曲线,内标法定量（一）,配制一系列浓度的标样，其中加有内标样,内标法定量（二）,采集不同浓度 标样的色谱图积分,按内标法 定量计算,建立 标准曲线,标准曲线,内标法定量（三）,对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其它色谱峰分离好,校正曲线的检测范围,校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误,样品分析方法介绍,1，流动相的准备流动相的选择-有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液）流动相的过滤-用孔径为0.45m滤膜过滤除去固体颗粒杂质。流动相的脱气-超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。2，样品的准备称量、用流动相超声溶解、调PH、去除蛋白、离心、过滤。,流动相及样品的准备,流动相过滤器样品过滤器,分析方法的设定,流动相的配比及流量-选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。紫外检测波长的确定-通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如2080)及终点配比(如8020)。,
