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1、基因工程的基本操作程序,第二节,四 目的基因的检测与表达产物的测定,基因工程的概念,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。,目的基因,获得新性状,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,为什么非要有载体和目的基因一同进入受体细胞呢？,研究发现，单个基因或DNA片段导入另一生物体的细胞后，往往会被细胞内的防御系统消灭掉，这样就大大降低了目的基因的表达效率；如果把目的基因包装一下，就很容易逃过受体细胞的防御系统，免遭“灭顶之灾”。,基因工程：把一种生物的某种基因
2、提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。,前面三个步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。,标记基因的作用在于便于检测目的基因的情况。因为标记基因和目的基因同位于运载体
3、上，要导入都导入，要表达则都会表达。一般标记基因的DNA序列是已知的，若选用抗氨苄青霉素基因，则可在目的基因导入后用氨苄青霉素来处理受体细胞，若无异常，则抗氨苄青霉素已合成，说明基因已得到表达。,标记基因,目的基因,启动子,终止子,复制原点,2.基因表达载体的组成,基因工程的概念,把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。,目的基因的获得,将目的基因导入受体细胞,获得新性状,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因在受体细胞中是否转录,是否翻译出相应的蛋白质,1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 这是目的基因能否在真核生物中稳
4、定遗传的关键。,DNA分子杂交,检测方法是：采用DNA分子杂交技术。先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。,两种生物的互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针与转基因生物的目的基因杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置能看到），则说明目的基因已经插入受体细胞的染色体DNA中。,基因探针：,是一小段单链的DNA或RNA,带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链碱基互补配对,2.检测目的基因
5、是否转录出了mRNA 这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。,分子杂交,采用DNA与RNA分子杂交技术。从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mRNA。,3.检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原-抗体杂交,从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。,如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度
6、。又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。,2.形态检测:,检测转基因生物是否表达出相应的性状 目标性状或标记基因的性状,1.分子检测,2.形态检测:,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,检测转基因生物是否表达出相应的性状 目标性状或标记基因的性状,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,归纳步骤,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,DNA与DNA杂交,检测目的基因是否转录出了mRNA,D
7、NA与RNA杂交,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金芽孢杆菌中提取毒蛋白，注入某种动物体内，从动物的血清中分离出相应的抗体，并用荧光标记该抗体，然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，如出现杂交带，则表明抗虫基因已经在棉花细胞中表达。,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR技术人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法；显微注射法；氯化钙法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测,1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，
8、联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,2.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,思考与探究,（2019福建）32现代生物科技专题肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺
9、癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图。,（）进行过程时，需用 _ 酶切开载体以插入let-7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为。,限制性核酸内切酶（或限制）_,启动子,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（2019福建）32现代生物科技专题 肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7
10、基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图。,（）进行过程时，需用 酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。,胰蛋白,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（）研究发现，let-7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图。据图分析，可从细胞中提取 进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞（RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。,RNA,RAS蛋白,“汉水丑生的生物同行”超级群大
11、型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（5）基因工程中除质粒外，和 也可作为运载体。,（4）反转录作用的模板是，产物是。若要在体外获得大量反转录产物，常采用技术。,（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是,mRNA（或RNA）,cDNA（或DNA）,噬菌体,未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱,PCR,动植物病毒等,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上 抗四环素的
12、基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有 四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大 肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如 果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已 进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎 后从中提取-珠蛋白。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,限制性内切酶和DNA连接酶,具有标记基因；能在宿主细胞中复制并稳定保存,“汉水丑生的生物同行”超
13、级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,卡那霉素,放射性同位素（或荧光分子）标记的抗虫基因,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗
14、性基因的传递符合孟德尔遗传规律。将转基因植株与_杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。,非转基因植株,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为_。,3:1,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。201
15、9年1月15日，汉水丑生标记。,（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。,100,练习1：(2019理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所 用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2019理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应
16、用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆 菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放 射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检 测，又要用 方 法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪/花粉管通道法,植物组织培养,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）,3.下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图,据图回答问题：在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株经测定甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶：乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶过程l 应选择_菌液的细胞提取总
17、RNA，理由是_ 过程中，根据图示，可以看出与引物结合的模版是_ 检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用_方法。,甲,甲菌液细胞的AFB1基因的表达已转录形成mRNA，而在已菌夜细胞中该基因未转录,AFB1解毒酶基因的cDNA,抗原-抗体杂交,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（2019江苏）27、下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,（1）一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游
18、离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 _。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna切割，原因是_。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。,0、2,高,Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因,质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 _。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突
19、变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。,DNA连接,鉴别和筛选含有目的基因的细胞,蔗糖为唯一含碳营养物质,（2019重庆）31.（16分）拟南芥是遗传学研究的模式植物，某突变体可用于验证相关的基因的功能。野生型拟南芥的种皮为深褐色（TT），某突变体的种皮为黄色（tt）,下图是利用该突变体验证油菜种皮颜色基因(Tn)功能的流程示意图。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（1）与拟南芥t基因的mRNA相比，若油菜Tn基因的mRNA中U
20、GA变为，其末端序列成为“”，则Tn比多编码个氨基酸（起始密码子位置相同，、为终止密码子）。（2）图中应为。若不能在含抗生素Kan的培养基上生长，则原因是。若的种皮颜色为，则说明油菜Tn基因与拟南芥T基因的功能相同。,2,重组质粒,重组质粒未导入,深褐色,（3）假设该油菜Tn基因连接到拟南芥染色体并替换其中一个t基因，则中进行减数分裂的细胞在联会时的基因型为_；同时，的叶片卷曲（叶片正常对叶片卷曲为显性，且与种皮性状独立遗传），用它与种皮深褐色、叶片正常的双杂合体拟南芥杂交，其后代中所占比列最小的个体表现_ 取的茎尖培养成16颗植珠，其性状通常_（填“不变”或“改变”）。（4）所得的转基因拟南
21、芥与野生型拟南芥_（填“是”或者“不是”）同一个物种。,TnTnt t,黄色正常、黄色卷曲,不变,是,（2019山东）35【生物现代生物科技专题】人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，未经允许不得擅自修改或用于任何形式的商业用途。2019年1月15日，汉水丑生标记。,（1）卵母细胞除从活体输卵管中采集外，还可以从已处死的雌鼠_中获取。（2）图中的高血压相关基因作为，质粒作为_二者需用 切割后连接成重组载体，该过程与质粒
22、上含有 有关。（3）子代大鼠如果 和_，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。,目的基因,载体,同种限制酶,限制酶切割位点,检测到体内有相关蛋白,出现高血压,卵巢,目的基因导入受细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只通过检测与鉴定才能知道。在检测与鉴定时我认为有以下五种检测鉴定：1、检测受体细胞中的标记基因是否表达，即是否表现出标记基因的性状，从而判断受体细胞中是否已导入含有目的基因的运载体。如果检测出标记基因表达的性状，说明运载体已导入受体细胞。2、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳
23、定遗传的关键。检测方法是：采用DNA分子杂交技术。先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。3、检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。采用DNA与RNA分子杂交技术。从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mRNA。4、检测目的基因是否翻译成蛋白质。从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。5、个体生物学水平的鉴定。如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。,谢谢！,
