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1、,专题 1 基因工程 1.2 基因工程的基本操作程序,1、简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理2、模拟重组DNA分子的操作过程,学习目标,考情分析,基础回顾,1、基因工程的基本操作步骤包括：_ _ _ _ 2、获取目的基因的方法包括：_、_、_等。3、PCR技术扩增目的基因的过程包括：_、_、_。4、基因表达载体的组成包括：_、_、_、_、_。,种类,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因组文库：含有一种生物的全部基因,基因文库,（1）基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当限制酶切割,许 多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,
2、（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,与载体连接导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA(cDNA),该生物cDNA文库,基因文库的构建,模板DNA,PCR反应动态演示,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程P
3、CR的特点,第2轮结束,变性90-95C,延伸70-75C,退火55-60C,PCR的基本反应步骤,2、引物之间不能有太多的互补序列。,1、引物序列不能太长。,引物的设计,3、引物自身不能有太多的互补序列。,PCR反应原理示意图,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、引物,高温变性解旋,解旋酶催化解旋,体外,主：细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,DNA聚合酶等,形成大量的DNA片段,形成完整DNA分子,边解旋边复制,先解旋后复制,DNA复制与PCR技术的比较,启动子、终止子的位置要注意什么？,基因表达载体的模式图,2、启动子、终止子与转录过程相关，起始密码子、终止密码子与翻译过程相关。,1、启动子、终止子均是DNA序列，起始密码子、终止密码子均是mRNA序列。,启动子、终止子与起始密码子、终止密码子（从本质、功能两方面）,基因表达载体的构建过程,弊端：易造成目的基因和质粒的自身环化和随意连接（正向、反向）。,改进：选择两种限制酶切割（双酶切法）,问题延伸,怎么选择限制酶？,1、两种限制酶切割形成的末端要不同。2、切割时不能破坏目的基因。3、切割时不能破坏质粒上的重要结构。例如：启动子、终止子等。,1、目的基因的获取从基因文库获取利用PCR技术扩增化学方法人工合成2、基因表达载体的构建目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点,课堂小结,
