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1、基 因 工 程,基因工程基本流程,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,用于基因克隆的载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,基因操作常用技术,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,2.6,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,真菌基因工程,高等动物基因工程,高等植物基因工程,蛋白质工程、途径工程,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒与噬菌粒,人工染色体载体,载体的基本概念,一、载体的基本概念,载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞
2、，使之传代、扩增或表达的工具。载体的主要功能：,运载：高效运载外源基因至受体细胞内,维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的,扩增：使外源基因拷贝数增加（克隆载体）表达：为目的基因表达提供顺式元件（表达载体）,2、载体应具备的条件,可转移性：具有针对受体细胞的“亲缘性”或“亲和性”（导入效率）,可筛选性：具有合适的筛选标记,具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主基因文库构建需要非常大的容量,方便外源基因克隆：具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(多克隆位点),可传代性：具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点（稳定遗传）,3、载体类型,克隆载体（cloning vect
3、or）主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。,表达载体（expression vector)除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。,1）按功能分：,3、载体类型,自主复制型载体含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。穿梭载体装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,整合型载体不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。,2）按传代特性分：,3、载体类型,质粒（Plasmid),噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus)考斯质粒（cosmid）噬菌粒（phagemid
4、）人工染色体（YAC，BAC）,3）按来源分：,二、质粒(plasmid),质粒的生物学特性,质粒载体的特点与类型,几个重要的质粒载体,质粒的制备与鉴定,（一）质粒的生物学特性,质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类DNA分子。,*质粒常见于原核细菌和真菌中,*绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，,即cccDNA（covalently closed circular DNA),*质粒DNA的分子量范围：1-300 kb,1、质粒的自主复制性,质粒是独立的复制子（replicon）：含复制起始位点（origin,ori)和控制复制频率的调
5、控基因 能利用宿主细胞的DNA复制系统进行自主复制,(ori),质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II（引物）,RNA I,3,5,5,3,63个氨基酸,提高RNAI的抑制,阐述质粒DNA复制调控机理的分子模型,1、抑制蛋白质稀释模型2、自体阻遏蛋白质模型,调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,起始因子,抑制蛋白质,如何通过
6、质粒改造提高质粒的拷贝数？,根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒：1-3 拷贝，如pSC101,松弛型复制控制的质粒：10-60 拷贝，如 ColE1,氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。,2、质粒的不相容性,质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
7、,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒的不相容性的分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。,3、质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下
8、，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,4、携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得宿主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,天然质粒的改造,野生型质粒的缺点：分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想改造策略：去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调控序列；引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因,pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb
9、拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,野生质粒,第二次课,选择性标记：供重组子筛选用的遗传标记基因,多克隆位点（MCS）供外源基因插入的、由单一切点内切酶组成的序列,（二）质粒载体的特点与类型,质粒载体关键元件：复制位点、选择性标记、多克隆位点,复制位点：供自主复制用的由复制起始位点和调控基因组成的短序列,质粒载体的特点：,分子量小，便于操作,易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架,用途广泛,缺点：装载量小（小于10kb），不能用来克隆大片段,（二）质粒载体的类型,人工构建的质粒载体根据其功能和用途可分成如下几类：
10、,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列,整合质粒 装有促进整合的基因，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,（三）重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,1、pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,2、pUC18/19：最优秀的常规克隆载体,
11、拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序，T载体的母载体,装有多克隆位点（MCS）,含AP和正选择颜色标记 lacZ,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理（互补）,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,半乳糖+5-溴-4-靛蓝,3、T载体：克隆PCR产物用,来自pUC18/19,多克隆位点中某处线性化，加装碱基T，以便和PCR产物的A互补。,此处线性化，加T,4、pGEM：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外
12、源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,E.coli BL21（DE3）等,（四）质粒DNA的制备与鉴定,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱裂解法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间,氯化铯密度梯度离心法：对质粒的构象要求较高时采用,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌
13、酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,第三次课,碱裂解法：最常用,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,
14、加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,二、噬菌体或病毒DNA,噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体,共同特点：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增可在裂解和溶原二种状态间转换,噬菌体或病毒DNA,（一）大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,1、l 噬菌体的生物学特性：,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,l 噬菌体的基因组结构,5 TCCAGCGG
15、CGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,Cos位点（12bp）,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,l 噬菌体的裂解周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,lamB受体：麦芽糖转运蛋白,被狗咬了一口,l 噬菌体的体内包装 包装范围为原DNA的75-105%：36-51 kb,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,串连多聚体,经滚环式复制形成串联重复,l 噬菌体的溶原状态,l噬菌
16、体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态,2、l-DNA载体的构建：1）缩短长度：按有效包装范围确定,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长
17、度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,插入型l-DNA载体：载量为0-14KB本身长度为包装下限，可以被包装。需使用载体标记基因进行筛选,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,取代型l-DNA载体：载量为10-25kb本身长度为40kb，须切开14kb。可以不需要标记基因,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（
18、36 26）,酶切口,2）删除重复的酶切位点，引入多克隆位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点,3）加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,加装选择标记：imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l
19、-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑,透明斑,浑浊斑,加装选择标记：lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）,琥珀型突变（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基
20、因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,3、l-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、lgt11,取代型载体,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正选择型载体,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），,这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外,源DNA取代red和ga
21、m，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌,体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑,4、l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,5、l-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有
22、麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,6、l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,（二）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,1
23、、M13噬菌体的生物学特性：,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,致使比其他区域的宿主生长慢,形成混浊噬菌斑,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,M13噬菌体的感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,V,2、M13 DNA载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,MCS,所有基因为增殖必需
24、，插入多克隆位点和标记基因,3、M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,（三）病毒载体,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时
25、大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,动物病毒载体,(1)具有动物病毒的复制起始位点(2)具有在动物细胞中能表达的选择标记(3)具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆 位点 目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒(Papilloma virus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：
26、,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.7 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,三、考斯质粒与噬菌粒,包装蛋白只识别cos信号，与DNA性质无关,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围非重组的载体分子不能被包装（包装下限所
27、致）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体复制起始位点序列,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IGDNA复制的起始区和包装信号位点,
28、pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,滚环复制,重要的噬菌粒载体：pBluescript（体外转录载体）,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,四、人工染色体载体,人类、动物、植物的全
29、基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，组蛋白包装形成人工染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人工染色体（BAC）,酵母人工染色体（YAC）,酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes,YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列：TEL,pYAC4,CEN4,EcoRI
30、,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子：ARS,酵母染色体的中心粒序列：CEN,酵母系统选择标记：URA3/TRP1,大肠杆菌的复制子:ori,大肠杆菌的选择标记:Ap,YAC载体的装载量为350-400 kb,酵母人工染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐,细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之
31、间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒,人工染色体载体,几类载体的比较,噬菌粒,大小组成导入宿主方式容量用途,第四次课,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,
32、2.4,基因操作常用技术,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,2.6,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4 DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,一限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用)两种不同来源的入-噬菌体 入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（K株，B 株）。当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一旦入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株,不能感染原来 K株.,一、限制性核酸内切酶,E coli
33、 K株 噬菌体,E coli K株,其他 E coli 菌株,限制现象,修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物 质和外来遗传物质的目的。,二限制和修饰作用的分子机制1大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶-识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。,2.入噬菌
34、体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）3当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解-（限制）4.由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株,不能感染原来 K株.)6细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制
35、性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染C株，而在 C株繁殖入-噬菌体则在 K株和 B 株 受到严格的限制作用,1、限制性核酸内切酶的功能与类型,细菌的限制与修饰作用：K/K株；B/株,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：负责限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,2种限切酶：Hind II和Hind III,限制外来DNA（酶切），修饰自身DNA（甲基化保护）,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease),限制性核酸内切酶的类型（1000多种）,主要特性 I 型 II 型（800
36、多种）III 型,功能,限切/修饰,限切,蛋白结构,异源三聚体,单体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内,距识别序列下游,24-26bp处,用于DNA重组,限切/修饰,II型限制性核酸内切酶,识别序列为4-6碱基对的回文对称结构,是DNA重组中最常用工具酶,识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。,单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性,II 型“限切酶”的识别与切割序列,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列：G/AATTC,EcoR I的切割位点,2、II型
37、“限切酶”的命名,属名 种名 株名,H i n d II H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,II型限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 质粒,EcoR I EcoR V,Eschericha coli R 大肠杆菌R质粒,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,3、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受影响（提取的质粒）,大肠杆菌中的dc
38、m甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,许多类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修饰抑制限切酶活性（前面加M）,5粘性末端3粘性末端平端,4、II 型“限切酶”的切割产物,53,35,53,53,35,35,3-OH,5-P,5-P,3-OH,EcoRI等产生的5粘性末端：,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5
39、G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来
40、源的酶 HindIII HsuI:A/AGCTT同尾酶：识别位点不同，但切出的片段具有相同 的末端序列 BglII：A/GATCT BamHI:G/GATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。,5、同裂酶与同尾酶,AGATCTTCTAGA,A GATCTTCTAG A,GGATCCCCTAGG,G GATCCCCTAG G,+？+？+？+？,6、“限切酶”酶活性定义,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,Volume,20-100 ml,T T,37 1-1.5 hr,1 U
41、核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量。,商品酶提供专用缓冲液,7、限切酶的“星活性”（Star activity）,指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和切割反应特异性下降的现象。,例：EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3 BamH I,第五次课,8、DNA末端长度对酶活性的影响,限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸
42、，否则限制酶将难以发挥切割活性。,在设计 PCR 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的 PCR 产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。,9、终止酶切活性的方法,1、EDTA2、加热3、苯酚抽提,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,二、T4 DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,A.修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,
43、P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,如：粘性末端退火后,B.修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处 的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶的基本性质,C.连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3
44、 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶的活性单位定义,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM(不能大于1 mM),DTT,Volume,10-20 ml,T T,4-15 4-16 hr(37 酶活性最高）,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。,T4 DNA连接酶的活性单位定义,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM(不能大于1
45、 mM),DTT,Volume,10-20 ml,T T,4-15 4-16 hr(37 酶活性最高）,在 20l 反应体系中于 16，使 Hind 切过的 DNA（300g/ml，0.12M 5 末端）在 30 分钟内连接 50%所需的酶量为 1 个 NEB 单位。此外一般还采用Weiss单位，1 Weiss67 NEB单位,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,1.DNA聚合酶,1）大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活
46、性（未配对的碱基）,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN（dNTP)Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,53的核酸外切酶活性,待切除的核酸分子必须具有5端磷酸基团核苷酸在被切除之前必须是已经配对的被切除的核苷酸可以是脱氧的也可以是非脱氧的,切口平移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-
47、A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,采用-32P-dATP,所有的DNA聚合酶中只有此酶有该反应,缺口平移标记原理,2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶：,大肠杆菌DNA聚合酶I经
48、枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,Klenow酶的基本用途之一：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C
49、-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,Klenow酶的基本用途之二：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,3）T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本
50、特性：,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性(极强),T4-DNA聚合酶用途之一：,切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,35的核酸外切酶活性,DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-
