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1、利用不同的方法筛选和鉴定转化子广州大学生命科学学院摘要:本实验通过使用限制性内切酶切割质粒,通过定向克隆相连,重组质粒用于转化细菌.然后对转化产物进行了筛选和鉴定.从所得的三个转化子中,经过PCR、琼脂糖电泳鉴定重组质粒大小与酶切后电泳的鉴定,最终从三个转化子中筛选出一个重组子.关键词:质粒提取 凝胶电泳 PCR 酶切1 引言质粒具有稳定可靠和操作简便的优点.再实际工作中,由于量少,连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒,连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒.同时,细菌的转化效率极低,进行转化后,绝大部
2、分细菌是没有被转化的.因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定.首先,通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子.将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选.只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落.其次,通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物,扩增出特殊目的基因片段,判断所得转化子是否为重组子.但因为PCR技术的高灵敏性,往往会产生假阳性结果.因此有必要进一步进行鉴定.最后从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致.2 材料与方法2.1 材料:实验十所得转化子2.2 用具:仪器:PCR仪,恒温摇床
3、,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,超净台,移液枪,1.5mL离心管2.3 试剂rTaq酶;10PCR buffer;dNTP mixtures(10mM)前向引物P1:5-CGCGAATTCATGGCAGATCAG-3反向引物P2:5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACACAAA-3限制性核酸内切酶Hind;ddH2O;限制性核酸内切酶缓冲液:10M buffer,0.5TBE buffer;EB母液;质粒提取试剂;酶切试剂;酶反应终止液;1%琼脂糖;无菌蒸馏水;6loading buffer;矿物油.溶液:50m mol/
4、L葡萄糖,10m mol/L EDTA,25m mol/L Tris-HCl(pH8.0),用前加溶菌酶4mg/L;溶液:NaOH溶液(内含1%SDS),0.2mol/L,现配现用;溶液(pH4.8):60mL 5mol/L乙酸钾,11.5mL冰醋酸,28.5mL H2O;LB液体培养基配方:胰蛋白胨0.25g,酵母提取物0.25g,NaCl 0.5g,加入50mL蒸馏水使其完全溶解.高温蒸汽灭菌(1.034MPa,1530min),待培养基降温至5560时,加入50L的100g/mL的氨苄青霉素母液,摇匀.按照比例配置培养基.2.2 方法2.2.1 转化子的筛选选出在实验十中,LB固体培养基
5、上生长出来的白色菌落.选取三个,做好标记.2.2.2 菌落直接PCR用无菌牙签分别挑取3个白色单菌落,在编好号码的PCR反应管中的底部分别涂抹,然后在PCR管仲配制20L反应体系.反应体系如下:DNA template buffer 用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹10PCR buffer 2LdNTP mixture 1.6LForward primer(P1) 0.8LReverse primer(P2) 0.8LrTaq enzyme 0.2LddH2O 14.6L所有试剂按量仔细添加后,轻轻混匀,稍离心即可.为了防止反应混合液蒸发,最后添加20L矿物油.PCR仪的参数设置94 4min9
6、4 30s62 30s 35 cycles72 30s72 5min琼脂糖凝胶电泳检测:反应结束后,取5L产品,加入1L 6loading buffer,混匀后点样,电泳15min.观察产物带.2.2.3 质粒提取及大小鉴定:照上述电泳的结果,用无菌牙签从平板上挑选PCR反应阳性菌落,与没有检测出特异性条带的假阳性菌落,接种于含Amp 50g/mL的5mL LB液体培养基中,37下震荡培养12h.2.2.3.1 质粒提取1.吸取1.4mL菌液至1.5mL离心管中.2.离心(8000rpm,1min),弃去上清液.3.加入150L溶液,用旋涡振荡器充分悬浮菌体.4.加入200L溶液,加盖后温和颠
7、倒56次,直至透明状.(此步骤在5分钟内完成)5.加入150L遇冷的溶液,加盖后反复颠倒混匀,直至出现白色絮状沉淀,冰浴5分钟.6.离心(14000rpm,10min,4),移取上清液于另一干净离心管中.7.向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1),振荡后均匀抽提,离心(14000rpm,5min),溶液将出现分层.8.移取上层水相溶液(约450L)于另一干净离心管,加等体积氯仿,振荡混匀抽提,离心(14000rpm,5min)9.移取上层水相溶液于另一干净离心管,加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇混匀,冰浴30min.10.离心(14000rpm,10m
8、in,4),倒掉上清液.11.加0.5mL预冷的70%酒精振荡,洗DNA沉淀一次,离心5分钟,倒掉上层清液.12.真空抽干或自然风干沉淀.13.加20L30L TE缓冲液使DNA完全溶解,降解RNA杂质,室温放置10min.用作琼脂糖电泳.14.各取5L质粒DNA加入1L 6loading buffer混匀,进行点样.15.电泳条件:120V,25min.电泳完成后,胶块通过凝胶成像系统检测,观察实验结果,并拍照记录.2.2.3.2 DNA浓度纯度的测定1.空白测定:吸取200L蒸馏水至比色杯,进行紫外光空白测定.2.DNA测定:取质粒DNA 1L至一干净的离心管,加入199L蒸馏水稀释混匀,
9、所有溶液加入到干净的比色杯中,测定260nm及280nm的光吸收值,记录DNA浓度及OD260nm/OD280nm比值.2.2.4 质粒酶切鉴定酶切反应液的配制Hind 1L10M buffer 2LDNA 5LddH2O 13L酶切反应条件:37 水浴23h.电泳检测:反应结束后,向反应液中加入2.2L 10loading buffer,混匀后停止酶切反应,所有22.2L样品.均在同一点样孔中.电泳条件:120V,45min.观察迁移率,对比marker.3 实验结果3.1 PCR产物电泳图图 1菌落直接PCR产物电泳图3.2 质粒DNA浓度纯度的测定序号DNA浓度(g/mL)OD260/O
10、D28014356.18951.861923151.55861.89443.3 质粒大小鉴定图 2质粒提取电泳图3.4 质粒酶切电泳鉴定图 3质粒酶切产物电泳图4 实验结果分析与讨论4.1 菌落直接PCR结果由于在前次转化实验中,培养基表面只长出了三个白色单菌落.于是,便直接挑取了三个菌落和阳性对照平板上的某个菌落直接PCR.结果如图1所示.从图1可以看出,编号为2的菌落并没有扩增出特异性条带.为了排除在操作上因为挑取过多菌落而导致不能扩增出特异性条带的情况,选取了转化菌落平板上能扩增出特异性条带的1号和不能扩增出特异性条带的2号进行摇菌.4.2 质粒提取与大小鉴定由图2可以看出,条带位于20
11、00bp处,符合质粒的理论大小.质粒DNA的图谱上,两个菌落均只看到了一个条带,其余条带很弱,并没有显示出来.在质量相同的情况下,各种DNA的迁移率为超螺旋线性开环.由于DNA分子的构型不同,电泳时受到阻力不同,导致了泳动速率的不同.对于相对分子质量相同的DNA分子,其物理构象越接近球状,泳动时遇到的阻力就越小,速率越快.所以,共价闭合环状超螺旋的构象最接近球状,速率最快.由于两者都只看到了亮度不高的一个条带,表明所提取的质粒DNA浓度不会很高.与旁边的电泳条带相比,本组得出的电泳图谱说明,所含的开环DNA较多,提取质粒时的损伤可能较多.OD260/OD280值均在适合的范围内,没有过多的蛋白
12、质杂质和已降解的DNA.4.3 质粒酶切电泳鉴定图3为两种质粒DNA酶切后电泳所得的图谱.编号为1的菌落,在DNA marker的250bp处有一个非常微弱的条带.下部分接近2000bp的条带,亮度较高.菌落2的图谱上只出现了1个DNA条带,在marker 250bp附近并没有出现相应条带,证明菌落直接PCR所得的结果没错.酶切所得的两个片段分别为6131bp和219bp.由于质量较小,CaM5的片段的电泳速率要快很多. 在蛋白质杂质很多的情况下,也会在6131bp的片段下端出现第三个条带.图中只看到了两个条带,说明全部质粒DNA已经被充分酶切,从另一方面验证了蛋白质杂质较少的结论.5 结论证实了转化试验中所得到的,标号为1的转化子为重组子,具有CaM5基因.6 综合讨论实验材料由转化实验所得,这次实验也可以说成是从另一面去检验上一个实验中的转化效率.所长出来的三个菌落,其中一个并不是含有目的基因的重组子.说明在进行制备感受态细胞时的操作有需要提高的地方.7 参考文献1 田长恩.生物工程上游技术实验指导.2008.6
