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1、科技大学2004届毕业论文（设计） 题 目： 丹参种子中氨基酸及蛋白质组分的初步研究姓 名： 专 业：生 物 技 术 院 （系）：生命科学学院 指导教师： 完成日期： 丹参种子中氨基酸及蛋白质组分的综合开发利用价值初步研究摘 要：本研究对商洛丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.) GAP基地丹参种子综合开发利用价值进行了初步研究。利用VS-KT-P型自动凯氏定氮仪分析了种子蛋白质总含量及蛋白质组分，121M型氨基酸分析仪测定种子所含氨基酸的种类。结果表明：丹参种子中蛋白质总含量为14.46%，其中谷蛋白含量最高占72.57%，其余依次为清蛋白17.03%、醇溶蛋白6.09%、
2、球蛋白4.31%，同时发现在丹参种子中含有多种人体必需的氨基酸，因此具有一定的营养保健价值。关键词：丹参种子; 凯氏定氮; 蛋白质; 氨基酸；营养价值Abstract： This study is to find out the utilization of Danshen(Salvia miltiorrhiza Bge.) seeds gained from Shangluo Danshen GAP base. We assayed the seeds protein gross contents and components by VS-KT-P micro-Kjeldahl Analyz
3、er, and analyzed varieties of amino acid by 121M Amino Acid Auto-analyzer. It shows that the total protein amounts in the seeds is 14.46%. Among the proteins, content of Gluteins is the highest, it amounts to 72.57%, and the other proteins are Albumines protein (17.03%), Prolamin protein(6.09%), Glo
4、bulin protein (4.31%). We also found that there are lots of essential amino acid in the seeds for human health. In conclusion, the Danshen seeds hold certain nutritious and healthy value.Key-words：DanShen(Salvia miltiorrhiza Bge.) seeds; micro-Kjeldahl; protein; amino acid; nutritious value前 言丹参（Sal
5、via miltiorrhiza Bge.）为唇形科鼠尾属植物。是常用重要中药材，其药用部分为干燥根及根茎，具有活血化淤、消肿止痛、养血安神的功效。1现代药理研究表明，丹参对心血管系统、血液系统的作用十分显著。此外丹参还有抗菌消炎、保肝、改善肾功能、保护胃黏膜等作用。2因此以丹参为原材料的各种制剂在临床上广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血管疾病、肝炎、急性肾炎、消化性溃疡、上呼吸道感染等的治疗。目前以知丹参作为中药材的药效有效组分为40多种二萜醌类和20多种酚酸类化合物，如丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酸、丹参素、原儿茶醛等。近年来，随着对丹参的化学药理的研究日益深入，应用丹参药物及其中所含
6、有的药用成分进行防病治病亦日趋增多，对丹参药物的需求量不断增加。在剂型制剂方面，近年来有发展了几种新剂型：注射液、复方丹参片、复方丹参滴丸、复方丹参胶囊、丹参多相脂质体、复方丹参膏、复方丹参气雾剂、滴剂、复方丹参酊等。此外,由于丹参含有维生素及微量元素锌、铜等。因此，可促进毛发黑色素的生长，亦能补足微量元素等的不足而造成的白发、黄发、头发干燥等症，添加于发用化妆品中，具有促进头发生长，使头发由白变黑的作用，如用其他天然提取物配合使用，则有止氧、去屑、防治脱发、乌发等功用。可用于研究生产各种养发乌法、护发的保健品。研究还表明，丹参能能有效的抑制体外肿瘤细胞的增殖，能有效提取拮抗乙肝毒核心抗原（H
7、beAg），有较好的抗病毒的作用，丹参酚酸A具有很强的抗氧化作用。1,15目前，对丹参的有效成分研究多集中于其药用部分，至今未见有关种子的化学成分的报道。丹参种子是丹参生产中的重要的副产品，一般亩产40kg左右，以陕西商洛地区每年种植8000亩丹参计算，可收获种子30万kg以上，数量十分可观。种子中蛋白含量的高低，是衡量其品质和营养价值的最重要的指标。不同蛋白组分的必需氨基酸含量也不相同。通常醇溶蛋白中缺乏Lys、Trp、Met及Ile等必需氨基酸，其营养价值最低。因此可通其蛋白组分的相对含量，判断蛋白质的品质。本文就丹参种子蛋白质及其组分进行分析，探讨其利用价值，为丹参的综合开发利用开辟新的
8、领域。1 材料与方法1.1试验材料 试验采用商洛丹参的种子为研究材料,由陕西天士力植物药业有限公司提供.1.1.1 测定前对样品的处理: 将种子在70-80下烘干4小时后置研钵中研磨至粉状脱脂备用。1.2研究方法 1.2.1 丹参种子蛋白质含量测定（凯氏定氮法）3,4,5,6：蛋白质的含氮量比较恒定平均约为16%，通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质的含量。种子中的氮化物可分为蛋白氮和非蛋白氮。用三氯乙酸溶出脱脂种子粉中的非蛋白氮化物（氨基酸、酰胺和无机氮），沉淀样品中的蛋白质并使二者分离。在催化剂条件下，用浓H2SO4消煮分解样品，使蛋白氮转化为氨态氮，并与浓H2SO4结合生成硫酸铵。加碱蒸馏
9、，使氨释放出来并吸收于一定量的硼酸中，再用标准酸滴定，求出样品之中氮含量，乘以16%的倒数6.25即可换算成蛋白质含量。（1） 用分析天平称去丹参种子粉二份：0.358g 和 0.362g ，分别加入2只100ml具塞三角瓶中。（2） 在三角瓶中加5%三氯乙酸20ml，置CZ-3磁力振荡器上振荡提取（非蛋白氮化物）1小时，过滤 ，弃滤液。用5%三氯乙酸洗涤滤纸上的沉淀，最后将漏斗里的沉淀连同滤纸一起放入1、2号消化管内，在3、4号消化管内个加一张相同滤纸，作为空白。（3） 在14号消化管内各加适量催化剂（Cu2SO4：K2SO4=1：9（w/w）及8ml浓硫酸，置消化炉上，200消化2小时左右
10、，然后生温至400在消化数小时，直至淡蓝绿色。（4） 待消化液冷却后，定容50ml，去20ml，用自动定氮仪进行蒸馏，滴定。根据仪器给出的标准浓硫酸的消耗体积进行手工计算。1.2.2 丹参种子蛋白质组分分析（连续累进提取法）3.4,5,6 根据清蛋白可溶于水，球蛋白可溶于稀盐溶液，醇溶蛋白可溶于乙醇，谷蛋白可溶于稀碱溶液的性质，可用不同溶剂把这四种组分从样品中分离提取出来，然后用凯氏法分别定量进行分析。 装柱（1） 称取酸洗并经540高温处理的石英砂40.0g与样品1.1307g混均，然后开始装柱：首先取一小团棉花，放置层析柱底部，另取石英砂20.0g，其中10.0g置于层析柱底部，将混合物装
11、入柱内，再将剩余的10.0g石英砂加入层析柱上部，装好后用小木棒轻轻敲打把空气排出。提取（2） 在提取前加20ml蒸馏水，排出柱内气体，浸湿样品，然后按下列步骤进行：a 加100ml蒸馏水，调节流速为0.5ml/min（大约5滴/分钟）提取清蛋白，定容于100ml容量瓶中。b 加100ml0.5molL-1NaCl，调节流速为0.5ml/min（大约5滴/分钟）提取球蛋白，定容于100ml容量瓶中c 加100ml70%乙醇，调节流速为0.5ml/min（大约5滴/分钟）提取醇溶蛋白，定容于100ml容量瓶中d 加100ml0.1 molL-1NaOH，调节流速为0.5ml/min（大约5滴/分
12、钟）提取谷蛋白，定容于100ml容量瓶中 (3) 提取液中蛋白质含量测定a. 从每一容量瓶中吸收10ml提取液放入消化管中(吸取时应摇匀后再吸),然后加8ml浓硫酸2.5g催化剂。每一提取液重复2次，设空白对照。用150加热0.5小时蒸干溶剂，然后用200消化2小时左右再升温400消化至淡蓝绿色。b. 待消化液冷却后，定容至50ml容量瓶，取其中20ml，上机进行含氮量测定。1.2.3 丹参种子蛋白质氨基酸组分分析（氨基酸自动分析仪法）3,4,5,6,16种子蛋白质在110条件下，经6.0 molL-1恒沸点盐酸作用2224小时，被水解生成组成蛋白质的各种游离氨基酸（色氨酸被破坏，天冬酰胺和谷
13、酰胺分别转变成天冬氨酸和谷氨酸），经上机前处理即可用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸的含量。（1） 准确称取丹参种子粉125.4mg，小心送入水解试管底部，加10ml6.0molL-1恒沸点盐酸，在超声波水槽中振荡除气后于喷灯上封闭管口，置110+1烘箱中水解24小时。（2） 冷却后切开试管，将水解液过滤到25ml容量瓶内，并无离子水冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。（3） 取5ml滤液置于蒸发皿中，在60水浴中蒸干，残留物用无离子水3-5ml溶解并蒸干，反复3次。（4） 准确加入pH2.2柠檬酸缓冲液10ml，溶解提取物。取1.5ml样品，在高速离心机上离心（15000r/min 15min）（
14、5） 用121MB型氨基酸分析仪专用注射器吸取上清夜50ul于样品贮存螺旋管中，上机分析。2结果与分析 2.1 丹参种子蛋白质含量其中V1、V2、V3、V4分别是滴定14号消化液消耗的标准浓硫酸的体积（ml），C1/2 H2SO4为标准浓硫酸的浓度，W为1，2号样品的平均重量（g）V1=11.25 V2=10.88 V3=0.19 V4=0.00C1/2 H2SO4=0.02169 molL-1 =0.360*2/5=0.144计算的蛋白质总含量为14.46%2.2丹参种子蛋白组分分析消耗浓H2SO4体积及蛋白质含量 V1（样品1#）V2（样品2#）V3（空白）Pr%清蛋白1.000.910.
15、002.49%球蛋白0.300.260.040.63%醇溶蛋白0.580.360.130.89%谷蛋白4.014.130.0010.61%C1/2 H2SO4=0.02169 molL-1 =0.0728根据其比例可得出谷蛋白含量最高占72.57%，其余依次清蛋白17.03%、醇溶蛋白6.09%、球蛋白4.31%。通常醇溶蛋白中缺乏赖氨酸（Lys.）、氨酸（Try.）、蛋氨酸（Met.）及异亮氨酸（Iieu.）等必需氨基酸，其营养价值最低，但其含量较少，故可预测丹参种子有营养开发价值。2.3丹参种子蛋白质氨基酸组分分析氨基酸分析仪采用外标法，根据标准氨基酸校正液的浓度和保留时间确定样品液中的各
16、种相应的氨基酸的浓度，主机随带的数据处理机和打印机，自动打印出各种氨基酸的浓度，结果如下表：（含量单位g/100g）项 目 名 称含 量 数 据天冬氨酸（Asp.）2.226苏氨酸（Thr.）0.8653丝氨酸（Ser.）1.252谷氨酸（Glu.）3.98脯氨酸（Pro.）1.014甘氨酸（Gly.）0.9787丙氨酸（Ala.）1.508胱氨酸（Cys.）0.2504缬氨酸（Val.）1.246蛋氨酸（Met.）0.2109异亮氨酸（Iieu.）0.8887亮氨酸（Leu.）1.621酪氨酸（Tyr.）0.9522苯丙氨酸（Phe.）1.43赖氨酸（Lys.）1.086组氨酸（His.）0
17、.6986精氨酸（Arg.）2.061总含量22.268824 丹参种子蛋白质同其他作物比较根据前面测定的结果，将丹参种子蛋白质同谷类及豆类作物种子7,9,10蛋白质比较如下：谷 类丹参种子豆 类Pr%大米高粱小麦小米玉米燕麦蚕豆黄豆绿豆豌豆6.4%10.4%12.8%9.9%7.8%14.3%14.46%32.5%39.6%22.4%24.3%可以看出丹参种子中蛋白质含量高于一般谷类作物低于豆类作物，说明丹参种子蛋白质具有较高的营养价值，此外未测定氨基酸的含量与种类有待进一步研究和开发利用。3 讨论 蛋白质在人的生理上有许多功能，供给生长、更新和修补组织的材料：供给必需的氨基酸：增强免疫力：
18、维护神经系统的正常功能：此外还有许多其他的功能。与肉类相比，植物蛋白质生产成本低且便于运输和储存，不过对人类而言，植物蛋白往往由于缺少某些必需的氨基酸而营养不够完全。一般说，禾谷类蛋白缺少赖氨酸（Lys.）和色氨酸（Try.），而豆类和蔬菜缺乏含硫氨基酸（如蛋氨酸Met.和半胱氨酸Cys.）。为了补偿这种缺乏，通常靠混合食品或生物技术在分子水平上改进植物蛋白质的营养价值8。丹参种子蛋白质含量相对较高。食物蛋白的营养价值的高低，主要取决于所含氨基酸尤其是必需氨基酸的种类、数量和组成比例。这主要是因为氨基酸是组成蛋白质的基本单位，是生物体内重要的营养物质，它在机体的营养代谢中起着重要的作用。氨基酸
19、含量是评价食品及其原材料营养性状的一项重要指标，也是营养学家进行配方设计时所必须参考的数据。从分析结果看，丹参种子中看17种氨基酸，其中天冬氨酸（Asp.）含量最高（2.226%），精氨酸（Arg.）、亮氨酸（Leu.）、丙氨酸（Ala.）次之。可作为食品填加剂，补充食品营养成分。开发植物蛋白质是合理调整食物结构的重要内容之一11，全世界蛋白产量的80%是植物性蛋白质，但在加工和利用方面不是很容易，因此新蛋白食品的开发，有效地利用了资源，提高了经济效益，而且使蛋白食品的营养价值得到提高，因此具有划时代的意义，另外新蛋白质填加到食品中，还可以改变食品的功能，改变蛋白单一的不足。因此，利用富含蛋白
20、质的丹参种子或其他植物性原料，可以开发出急具营养保健作用，还具有特定调节和改善人体生理和病理的产品。结 论丹参种子蛋白质含量不低，高于一般粮谷类，且蛋白质中基本包括所有的必需氨基酸，（色氨酸Trp）并与FAO/WHO建议的氨基酸模式12,13,14接近。尤其天冬氨基酸含量高，可作为天然天冬氨基酸源强化豆、谷类食品。另外可作为食品的添加剂，提高食品蛋白质的生物价，补充食品营养成分。由于此项研究目前在国内刚刚起步，有关丹参种子的综合利用、加工工艺等问题要考虑丹参产量与种子产量的矛盾，两者经济效益的矛盾。以上只是对丹参种子研究开发的一个可能性探讨。另外，丹参种子中维生素等指标有待进一步测定。参考文献
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23、les.Westport,CT:AVI,1980.39515肖培根，新编中药志第一卷，北京：化学工业出版社，2002，21222916宋治军、纪重光主编.现代分析仪器与测试方法，西安：西北大学出版社，1995.4：150152致 谢本论文是在 老师的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验设计到结果分析无不凝结着 老师的汗水和心血。虽说素昧平生，虽然仅仅3个月的时间，但 老师却给了我学习和生活方面的精细指导、帮助和无微不至的关心。在此，我首先向 老师致以深深的谢意！衷心感谢 老师的悉心指导！衷心感谢 老师、 老师在实验中给予我的耐心指导和无私帮助！衷心感谢多年来曾传授我知识、给予我教导和帮助的每一位老师。我的成绩凝结着你们的无私奉献和辛勤汗水；感谢 老师在这过程中从生活、学习到精神各方面对我的帮助与支持；感谢曾与我共同学习、共同生活过的2000级生物技术的全体同学，还有所以曾经给予我关心鼓励的同学、朋友们。大家的友爱给予我温暖也给予我克服困难的勇气，真得很谢谢你们！最后对爸爸妈妈的养育之恩，表示深深的谢意，我在你们的关爱和期望中成长，希望我努力的结果能让你们感到一丝欣慰！感谢今天在座的每一位老师、同学，谢谢！
