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1、HPLC 法测定茜草中大叶茜草素、羟基茜草素含量林文华，朱喜梅，严萍，詹若挺，刘翠婷，张洁*510（广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广州510006）摘要：【目的】建立茜草中大叶茜草素、羟基茜草素的 HPLC 含量测定方法。【方法】采用LUBEX Ecosil C18 柱（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为甲醇-乙腈-0.05%磷酸水（25:50: 25），流速 1.0 mL min-1，检测波长为 250 nm。【结果】大叶茜草素和羟基茜草素分别在 19.34161.20 gmL-1（r2=0.9999）和 12.16101.30 gmL-1
2、（r2=0.9997）范围内呈良好线性，平均回收率分别为 97.27%（RSD=1.91%）和 100.00%（RSD=1.87%）。【结论】该方法操作简单，重复性好，可作为茜草中大叶茜草素和羟基茜草素的含量测定方法，为合理制定茜草的含测方法提供参考。152025关键词：茜草；大叶茜草素；羟基茜草素；含量测定中图分类号：R284.1HPLC determination of rubimaillin and purpurin in Rubiacordifolia L.LIN Wenhua, ZHU Ximei, YAN Ping, ZHAN Ruoting, LIU Cuiting, ZHANG
3、 Jie(Research Center of Chinese Herbal Resource and Engineering, Key Laboratory of LingnanChinese Medicinal Resource, Ministry of Education, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006)Abstract: Objective To establish a HPLC method to determine the content of rubimaillin andpurpurin in
4、 Rubia cordifolia L. Method LUBEX Ecosil C18 column（4.6 mm250 mm，5 m）was used with methanol- acetonitrile- 0.05% phosphoric acid solution as the mobile phase, theflow rate was 1.0 mLmin-1 and the PDA detective wavelength was set at 250 nm. Result Therubimaillin had a good linearity relationship betw
5、een 19.34-161.20 gmL-1（r2=0.9999）,the purpurin showed a good linearity relationship whithin the range of 12.16-101.30 gmL-130（r2=0.9997）, and the recovery rates of rubimaillin and purpurin were 97.27% （RSD=1.91%）and 100.00%（RSD=1.87%）. Conclusion The method is simple , reproducible and stable, which
6、can be used as the content determination method of rubimaillin and purpurin in Rubia cordifoliaL.Key words: Rubia cordifolia L.; Rubimaillin; Purpurin; Content determination350 引言茜草为茜草科植物茜草 Rubia cordifolia L. 的干燥根和根茎，主治吐血、衄血、外伤出血、风湿痹痛等。主要含有蒽醌、萘醌及其苷类，环己肽类、萜类等140茜草素为检测指标，其中羟基茜草素为 2010 年版新增的检测项目，需通过提取
7、、基金项目：教育部 2011 年博士点基金基于 Mincle 受体的祛风湿中药抗炎成分研究（20114425120010）作者简介：林文华（1988-），女，硕士研究生，主要研究方向：中药质量控制新技术、新方法通信联系人：严萍（1976-），女，副研究员，主要研究方向：药物分析. ycyyp22-1-，中国药典2010 年版一部中，茜草含量测定项下主要以大叶茜草素、羟基蒸干、溶解、水解、碱化等多个步骤，方法步骤较为繁琐，检测历时较长，另外样品蒸干后难以将提取物完全转移2-3，因此本研究主要对茜草的含量测定方法进行优化，简化样品前处理方法，建立一种简便、快速、准确的含量测定方法。451 仪器与材
8、料1.1仪器Waters e2695 高效液相色谱仪（四元泵自动进样系统）、Waters 2998 二极管阵列检测器、Empower 化学工作站（美国 Waters 公司）；Milli-Q 超纯水系统（法国 Millipore 公司）；BS224S 电子分析天平（德国 Sartourius 公司，万分之一）；50XR205SM-DR 电子天平（瑞士 Precisa 公司，十万分之一）；PTHW 型恒温电热套。1.2试药大叶茜草素（批号：110884-200203）、羟基茜草素（批号：111898-201101）均购自中国药品生物制品检定所；茜草药材及饮片共 10 批，经广州中医药大学55詹若挺
9、研究员鉴定为正品茜草。甲醇、乙腈（德国 Merck 公司）为色谱纯，水为超纯水，盐酸等其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1色谱条件色谱柱为 LUBEX Ecosil C18（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为甲醇-乙60腈-0.05%磷酸水（25:50:25，V/V/V）；体积流量为 1 mLmin-1，检测波长为 250nm；进样量为 10 l。2.2对照品溶液的制备称取大叶茜草素对照品约 8 mg，精密称定，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为 0.806 mgmL-1 的大叶茜草素储备液。另称取羟基65茜草素对照品约 10 mg。精密称定，置 20
10、mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为 0.5065 mgmL-1 的羟基茜草素储备液。再精密吸取上述储备液适量，加甲醇制成含大叶茜草素 0.0967 mgmL-1，羟基茜草素 0.0405 mgmL-1 的混合标准溶液。-2-702.3供试品溶液的制备取本品粉末约 0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-25盐酸(4：1)混合溶液 100 mL，加热回流 30 min，冷却，用甲醇-25盐酸(4：1)混合溶液补足减失重量，滤过，精密吸取续滤液 20mL，加入 4 mL 三乙胺，摇匀，转移至 25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。752.4系统适应
11、性试验取适量供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图，考察系统适应性，结果如图，供试品色谱与对照品色谱在相同时间上有对应的吸收峰，表明系统适应性良好。图 1对照品和供试品溶液 HPLC 图谱802.5Figure 1 High pressure liquid chromatograms of reference and sample线性关系的考察取已知浓度的混合对照品溶液，加甲醇分别稀释成不同浓度的溶液：19.34gmL-1 的大叶茜草素，12.16 gmL-1 的羟基茜草素；25.79 gmL-1 的大叶茜85草素，16.21 gmL-1的羟基茜草素；38.69 gmL-
12、1的大叶茜草素，24.31 gmL-1的羟基茜草素；51.58 gmL-1 的大叶茜草素，32.42 gmL-1 的羟基茜草素；96.72 gmL-1 的大叶茜草素，60.78 gmL-1 的羟基茜草素；128.96 gmL-1的大叶茜草素，81.04 gmL-1 的羟基茜草素；161.20 gmL-1 的大叶茜草素，-3-101.30 gmL-1 的羟基茜草素，精密吸取各对照品溶液 10 l，注入液相色谱仪。90按 2.1 项下的色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算，得大叶茜草素的回归方程为有Y=36279X - 7037.8（r2
13、=0.9999），羟基茜草素的回归方程为 Y= 77310X 223822（r=0.9997），表明大叶茜草素在 19.34161.20 gmL-1，羟基茜草素在 12.16101.30 gmL-1 范围内呈良好线性。952.6重复性试验取同一批茜草饮片（批号：20130303-1）6 份，按 2.3 项下的方法平行制备，测得大叶茜草素平均含量为 1.07%（ RSD%=1.71%），羟基茜草素为 0.64%（RSD%=1.82%），表明该方法重复性良好。1002.7精密度试验精密吸取 2.3 项下的同一份供试品溶液 10 l，按 2.1 项下色谱条件重复连续进样 6 次，测得大叶茜草素平均峰
14、面积为 1678446，RSD%为 0.73%；羟基茜草素平均峰面积为 1635960，RSD%为 1.07%。2.8稳定性试验取 2.3 项下的同一份供试品溶液分别于 0、4、8、12、16、20、24 h 进样 10105l，测得大叶茜草素平均峰面积为 1673471，RSD%为 0.44%，羟基茜草素平均峰面积为 1666130，RSD%为 1.24%，表明供试品溶液在 24 h 内基本稳定。2.9加样回收率试验取上述已知含量的茜草（批号：20130303-1）6 份，取约 0.25 g（已知含大叶茜草素约 2.68 mg，羟基茜草素约 1.69 mg），精密称定，置具塞锥形瓶中，分11
15、0别精密加入大叶茜草素对照品约 2.68 mg，羟基茜草素约 1.57 mg，按 2.3 项下方法平行制备，按 2.1 项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表 1，表明该方法准确度良好。表 1茜草中大叶茜草素、羟基茜草素加样回收测定结果（N=6）Table 1 Recovery of rubimaillin and purpurin from Rubia cordifolia L.序测得量/mg回收率%平均RSD%号RubPurRubPurRubPurRubPur125.26375.27233.20603.180996.3796.53103.21101.45-4-35.24483.138195
16、.5198.7197.27100.001.911.874565.25125.33035.36923.14003.14683.125695.9098.86100.4398.9999.4398.20115注：Rub 为大叶茜草素，Pur 为羟基茜草素。2.10 样品含量测定按照 2.1 项下方法制备供试品溶液，分别对 10 批样品进行测定，并与按照药典方法测定的结果进行比较，结果见表 2。表 2茜草含量测定结果120Table 2 Content of rubimaillin and purpurin from different batches of Rubia cordifolia L.编号批
17、号产地大叶茜草素%本法 药典法羟基茜草素%本法 药典法总量%本法药典法12345678910120816120903120627130117021304149620130303-12013050220130220-120130303-220130220-2陕西安徽陕西湖北云南河北陕西山东安徽河南0.610.780.750.600.571.071.331.031.611.190.500.610.550.520.500.630.690.611.170.870.670.860.860.680.730.640.710.860.730.850.200.260.260.230.250.390.380.47
18、0.360.291.281.641.611.281.301.712.041.892.342.040.700.870.810.750.751.021.071.081.531.163 讨论本研究通过实验改进了大叶茜草素及羟基茜草素的提取方法，采用甲醇-25%HCl 直接加热回流，简化了操作步骤，减少了操作误差；实验结果表明（表2），本实验方法提取率明显高于药典方法。125130提取溶剂考察了甲醇、乙醇、水、酸性溶剂的提取率4-5，发现前三者提取所得的供试品中只有大叶茜草素，无羟基茜草素。羟基茜草素为羟基蒽醌类成分，一般羟基蒽醌类衍生物及其相应的苷类在植物体内多通过酚羟基或羧基结合成镁、钾、钠、钙盐
19、形式存在，为充分提取出蒽醌类衍生物，必须预先加酸酸化使之全部游离后再行提取，故选用酸性溶剂作为提取溶剂6-7。酸性溶剂考察了14%、10%、6%、2%盐酸甲醇溶液及甲醇-25%HCl （4：1）；结果显示，大叶-5-茜草素的提取率依次为 0.92%、0.93%、0.92%、0.93%、0.93%，羟基茜草素的提取率依次为 0.54%、0.52%、0.48%、0.41%、0.56%，表明甲醇-25%HCl （4：1）的提取效率最高。比较了超声和加热回流两种不同提取方法，结果两种方法对大叶茜草素的提135140145150155取率差异不大，但加热对羟基茜草素的提取率较高，故提取方法选用加热回流。
20、另外，比较溶剂用量，提取次数以及是否浸泡过夜，结果以 100 mL 溶剂加热回流 30 min 效果最佳，浸泡过夜对提取率影响不大，故无需浸泡。由于考虑到色谱柱所能承受的 pH 范围有限，同时，为取代掉溶剂中剩余的Cl，参考药典方法，最后需加入三乙胺。当三乙胺加入量为 2、3、4 mL 时，溶液 pH 分别为 0.03、0.26、2.63，测得大叶茜草素为 0.95%、0.95%、0.97%，羟基茜草素为 0.56%、0.57%、0.57%，即在该范围内，不同 pH 值时所测得的含量差异不大。继续加入三乙胺，当供试品溶液颜色突然加深，由棕黄色变为深红色时，三乙胺加入量约为 4.55 ml，测得
21、 pH7，同时所测得的羟基茜草素含量较低，为 0.37%，故本实验综合考虑色谱柱 pH 范围和检测结果，确定了加入三乙胺的量为 4 mL。参考文献 (References)1 国家药典委员会.中国药典（一部）S北京：化学工业出版社，2010：218.2 张琳，彭亮，胡本祥.茜草的化学成分研究进展J.现代中医药，2008，28（2）：52-54.3 郭桂明，蔡乐，梁小雨，等.HPLC 法测定茜草饮片中大叶茜草素和羟基茜草素的含量J.北京中医药，2011，30（7）：541-543.4 陈星，王侃，单鸣秋，等.UPLC 测得茜草炭中 4 中醌类成分的含量J中国中药杂志，2012，37（19）：2922-2925.5 Banyail P, Kuzovkina I N, Kursinszki L, et al. HPLC Analysis of Alizarin and Purpurin Produced by Rubiatinctorum L. Hairy Root Cultures. JChromatographia, 2006, 63:S111-S114.6 陈小全，杨晓东，邵辉莹，等.超声波作用下提取茜草色素及稳定性实验J泰山医学院学报，2013，34（3）：173-176.7 吴立军，等.天然药物化学M北京：人民卫生出版社，1988：158.-6-
