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1、单色光对肉鸡脾细胞增殖反应的影响1谢电，陈耀星*，王子旭，董玉兰 中国农业大学动物医学院，北京（100094) E-mail: yxchen摘要: 目的: 探讨单色光对肉鸡脾细胞增殖作用的机制。 方法: 采用红（660nm）、绿(560nm)、蓝(480nm)和白(400700nm)四种发光二级管作为光源对 120 只刚出壳 AA 雄性肉 鸡进行光照，试验期为 7 周，光照时间为 23h，光强度为 15 lx，利用双重免疫组织化学染色 和脾淋巴细胞体外培养方法检测脾细胞的增殖反应。 结果: 增殖细胞核抗原（PCNA）阳性 细胞百分率在白光组与蓝光组中比红光组分别显著提高 95.6和 54.4（
2、P0.05）。诱导型 一氧化氮合酶（iNOS）阳性细胞百分率在红光组比白光组和蓝光组分别显著高出 231.3和381.8（P0.05）。免疫组织化学双染结果显示，红光组中有 21.6的 PCNA 阳性细胞表达 iNOS，与其他各组比较差异显著（P90%,同时进行活细胞计数。最后用含 20mg/mL -甘露糖苷的 RPMI1640 完全培养液 调整靶细胞浓度至 1107 个/mL 备用。IL-2 诱生活性的检测 96 孔细胞培养板每孔加入 RPMI1640 完全培养液 50L,再加入待测 IL-2 样品(用 RPMI1640 完全培养液进行 110 稀释),每孔加入 1107 个/mL 靶细胞
3、50L。每 样品设置 3 个重复孔,并设 RPMI1640 完全培养液空白对照。置 5% CO2、40细胞培养箱静 置培养 30 h,每孔加入 5mg/mL MTT(四甲基偶氮唑盐)溶液 10L,继续培养 6 h。每孔再加入100L 10%SDS-0.04 mol/L HCL 溶液,继续培养 2 h,使紫色结晶完全融解，用 ELISA 免疫检测仪在 570nm 波长测定 OD 值。1.2.4 脾淋巴细胞 NO 的测定脾淋巴细胞分离培养及处理同上,按文献10方法进行。将 1107 个/ml 的细胞悬液 190L 加入 96 孔培养板中,加入 ConA 溶液(终浓度为 45 ug/mL),培养体系
4、为 200L,置 5% CO2 40 下孵育 48 h,取 100L 上清液加入 96 孔酶标板中，再加入等体积 Greiss 试剂,室温反应 20min, 最后在酶联免疫检测仪上测定 550nm 处吸光度,同时做标准曲线，计算 NO 浓度，单位 mol/L。1.3 统计分析数据处理采用 SAS9.0 软件进行方差分析和统计，结果以平均值标准差表示，P0.05为差异显著。2 结果2.1 免疫组化染色结果PCNA 阳性细胞其阳性颗粒为棕黄色，位于细胞核内（图 1）。细胞计数结果显示 PCNA阳性细胞数占脾细胞总数的百分率在白光、红光、绿光和蓝光组分别为 44.62.5，22.83.0，26.53
5、.2和 35.23.0（图 2a），这些结果显示 49 日龄时白光组和蓝光组增值程度较 高，而红光的作用最不明显, 白光组和蓝光组比红光组分别显著提高 95.6 和 54.4 （P0.05）。iNOS 为绿色荧光在细胞浆中表达，细胞形态多呈圆形，卵圆形，少量为梭形（图1）。细胞计数结果表明 iNOS 阳性细胞数占脾细胞总数的百分率红光组要显著高于其他光色 组，其中红光组比白光组和蓝光组分别显著高出 231.3和 381.8（P0.05）（图 2b）。免疫组织化学双染结果显示，红光组中约有 21.6的 PCNA 阳性细胞表达 iNOS，这一 比值在白光、绿光和蓝光组中分别下降到 8.9、11.4
6、和 10.8，且差异显著（P0.05）（图2c）。另外，脾细胞总数中 PCNA 和 iNOS 的共表达率也是红光组最高（4.90.5），与其他 各组比较差异显著，分别比白光组和蓝光组高出 22.5和 28.9（P0.05）（图 2d）。图1 49日龄肉鸡脾细胞PCNA和iNOS双重免疫组织化学染色。PCNA为细胞核棕色染色，iNOS为绿色荧光在细胞浆中表达。A/a，B/b，C/c和D/d分别为白光、红光、绿光和蓝光组肉鸡脾细胞中PCNA和iNOS双染。 箭头所指为双染细胞。Bar = 30m.Fig. 1 Dual immunohistochemistry staining for PCNA
7、and iNOS in the spleen cells of broilers at 49 d of age. PCNA is observed as brown nuclear staining and iNOS+ staining is visualized as green cytoplasm fluorescence. A/a, B/b, C/c and D/d are dual-staining for PCNA and iNOS in the spleen cells of broilers reared under WL, RL, GL and BL groups, respe
8、ctively. Arrowheads indicate dual labeled cells. Bar = 30m.图2a 脾细胞中PCNA阳性细胞率柱状图；图2b脾细胞中iNOS阳性细胞率柱状图；图2c双染细胞数占PCNA阳性细胞数的百分率柱状图；图2d双染细胞数占脾细胞总数的百分率柱状图。标不同字母者表示差异显著（P蓝绿红光组，红光组与其 他各组比较显著降低（P0.05），并且各组间比较差异显著（P绿蓝白,红光组 与绿光，蓝光和白光组比较差异显著（P0.05)。红光组的浓度最高，蓝光组的浓度最低，且红光组比蓝光组高出 63.7。表1 单色光对49日龄肉鸡脾淋巴细胞IL-2活性和NO生成的
9、影响Table. Effects of various monochromatic lights on splenocyte IL-2 bioactivity and NO production of broilers at 49 d of age项目白光红光ItemWLRL IL-2 活性（OD 570 nm）绿光蓝光GLBLIL-2 activityNO 浓度（ mol/L）NO concentration1.540.07a0.810.09d1.090.06c1.31 0.09b5.070.81b8.380.89a5.270.41b5.120.63b注：同一行标注不同字母表示差异显著（P0
10、.05）。Values with the different small letters within the same line differ significantly (P0.05).3 讨论3.1 单色光对肉鸡脾细胞 PCNA 表达的影响增殖细胞核抗原（PCNA）是一种分子量为 36kD 的蛋白质，它能够客观反映细胞的增殖 程度，可以作为一种理想的增殖细胞标志。PCNA 免疫染色基本着色于细胞核上，强阳性细 胞的胞核呈棕黄色，阳性细胞的核呈黄色。本试验观察到，肉鸡 49 日龄白光组和蓝光组脾 细胞 PCNA 阳性细胞表达率要显著高于红光组和绿光组，说明白光和蓝光能促进肉鸡脾脏 细胞不断
11、增殖。3.2 单色光对肉鸡脾淋巴细胞 IL-2 活性的影响IL-2 是一种重要的细胞因子，是由辅助性 T 细胞、外周单核细胞和脾淋巴细胞在有丝 分裂原或特异抗原刺激下分泌的可作用于 T 细胞本身的一种糖蛋白，又叫 T-细胞生长因子， 在免疫调节中起着非常重要的作用，例如可以促进抗原或有丝分裂原活化的 T 细胞从 G1 期 进入 S 期，维持细胞增殖 9。从以上结果可以看出,脾细胞的增殖和 IL-2 活性之间有着必然 的联系，活化的脾细胞分泌 IL-2，产生的 IL-2 以自分泌或旁分泌的方式作用于脾细胞，促 进自身的增殖。因此，促进 IL-2 的分泌，其本身就可促进脾细胞的转化和增殖。本实验结
12、 果显示白光和蓝光能提高肉鸡脾淋巴细胞 IL-2 活性，这与 49 日龄白光和蓝光均能促进脾细 胞增殖的试验结果相一致。3.3 单色光对肉鸡脾细胞 iNOS 表达的影响在动物体内，以 L-精氨酸(l-arginine,L-Arg)和分子氧为底物,在 NOS 的作用下合成 NO， NOS 是合成 NO 的唯一限速酶。目前认为巨噬细胞源性 NOS(NOS2)为诱导型 NOS(inducible NOS，iNOS)，其活性取决于基因转录而不依赖于钙/钙调素(Ca2+ /CaM)的调节，作用缓慢而 持久，多种因素如细胞因子、细菌脂多糖(LPS)均可持续诱导产生高水平的 NO11,12。本实验 观察到肉
13、鸡 49 日龄时红光组超过 37.1的脾细胞表达 iNOS，但这一比率在白光、绿光和蓝 光组分别显著下降至 11.2、20.7和 7.7。双染结果也证明红光组中 PCNA 和 iNOS 在 超过 4.9的脾细胞中共表达，这一比率在其他光色组中呈显著下降趋势。另外，双染细胞 与 PCNA 阳性细胞的比值在红光组中也是最高的。这说明红光能够促进 iNOS 在脾细胞中的 表达。3.4 单色光对肉鸡脾淋巴细胞 NO 生成的影响NO 是新发现的具有广泛生物活性的信息分子,在免疫调节中起重要作用，例如影响 T- 淋巴细胞增殖。Badovinac13研究发现 NO 对淋巴细胞增殖的作用与浓度相关,他认为低浓
14、度 SNP（NO 供体）能促进 IL-2 诱导的淋巴细胞增殖，其作用依赖于释放的 NO，而高浓度 SNP 则抑制了 IL-2 诱导的淋巴细胞增殖。这与本试验结果相一致,即肉鸡 49 日龄时红光能够促进 iNOS 在脾细胞中表达，进而产生较高浓度的 NO,则抑制了 IL-2 诱导的脾淋巴细胞增殖。4 结论由本试验可以得出以下结论：在光强度为 15 lx 的条件下，给与肉鸡 49 天单色光照明， 蓝光（660nm）可明显促进肉鸡脾细胞的增殖，提高脾细胞的免疫功能，其作用机理可能与T 细胞受有丝分裂原刺激活化产生的 IL-2 活性以及脾细胞 iNOS 的表达量和脾淋巴细胞 NO的生成量有关。参考文献
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21、tesJ. Scand J Immunol, 2000, 52(1):62-70.Effects of monochromatic light on proliferation responses in the spleen cells of broilersXie Dian，Chen Yaoxing，Wang Zixu，Dong YulanCollege of Animal Medicine，China Agricultural University，Beijing(100094)AbstractObjective To investigate the effect mechanism of
22、 various monochromatic lights on spleen cells proliferation of broilers. Methods A total of 120 day-old AA male broilers were exposed to red (660nm, R), green (560 nm, G), blue (480 nm, B) and white (400700 nm, W) ligh（tL）from light emittingdiode (LED) lamps for seven weeks, all light sources were e
23、qualized under 15 lx light intensity and applied for 23 hr daily. Responses of spleen cells proliferation were assessed by usingdule-immunohistochemistry staining and colorimetric test in cultures of purified splenic cells. Results The relative percentages of PCNA immunopositive (PCNA+) cells accoun
24、ting for the total spleen cells in WL and BL groups were significantly increased 95.6% and 54.4% than that of RL group,respectively (P0.05). The percentage of iNOS immunopositive (iNOS +) cells in RL group was significantly increased 231.3% and 381.8% than that of WL and BL groups, respectively (P0.
25、05).Dule immunohistochemistry results showed that about 21.6% PCNA+ cells express iNOS in RL group, and significant difference was found in RL group than in other light groups (P0.05). The percentage of dual staining cells accounting for spleen cells in RL group was the highest (4.90.5) compared wit
26、h other light groups (P0.05). Broilers reared under RL had significantly inhibited spleen cellsproliferation and IL-2 bioactivity when splenocyte NO concentration was higher compared with other light groups. Conclusion Broilers reared under 15 lx light intensity by LED lamps, blue light could promot
27、e spleen cells proliferative responses, mainly due to alterations of IL-2 bioactivity, iNOS expression and signaling molecule NO concentration in splenocyte.Keywords：Monochromatic light；spleen cells；proliferation；dule-immunohistochemistry；broilers作者简介：谢电（1977-），男，广西靖西人，博士生，研究方向为神经免疫学和黏膜免疫学； 陈耀星，教授，博士生导师，通讯作者。
