《土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列扩增与分析毕业论文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列扩增与分析毕业论文.doc（18页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列扩增与分析摘要：目的 PCR扩增并测定黑龙江省大庆地区牛源土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）核糖体28S LSU序列，构建分子进化树，探讨土耳其斯坦东毕吸虫在裂体科中的分类地位。方法 以SDS-蛋白酶K法抽提土耳其斯坦东毕吸虫基因组DNA，应用特异引物PCR扩增28S LSU序列，产物经纯化后连接到pMD18-T载体，克隆并测序，并构建土耳其斯坦东毕吸虫分子进化树。结果 土耳其斯坦东毕吸虫的28S LSU序列为1 304 bp，构建的进化树显示土耳其斯坦东毕吸虫处于裂体属内，同时处于非洲血吸虫种群。结论 土耳其
2、斯坦东毕吸虫应归属于裂体属。关键词：土耳其斯坦东毕吸虫；28S LSU序列；进化树；分类28S LSU sequence of Orientobilharzia turkestinicum amplified and construction phylogentic treesAbstract: Objective The 28S rDNA-LSU（28S ribosomal DNA large-subunit sequences）of Orientobilharzia turkestinicum from cattle were amplified by PCR and cloned int
3、o pMD18-T easy vector and then sequenced, counstucted phylogeny tree then determined the molecular phylogeny. Methods Genomic DNA was extracted from parasites isolated from individual host by SDS-proteinase K method. The 28S LSU sequence were amplified by PCR and cloned into pMD18-T vector and then
4、sequenced. Phylogenic trees were generated using the MEGA 3.1 software. Results 28S LSU were 1 304 bp. Phylogenetic analyses based on the 28S LSU sequence revealed that O. turkestanicum is placed within the schistosoma and belong to African schistosomes group. Conclusion O. turkestanicum should be c
5、onsidered a species belong to Schistosoma.Key words: Orientobilharzia turkestanica, 28S LSU, phylogentic tree, position目 录前 言11 材料与方法11.1 试验材料11.2 试验方法22 结果52.1 28S LSU序列的扩增52.2 重组质粒DNA的鉴定52.3 目的基因测序结果6 2.4 基于土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列构建的进化树73 讨论84 结论9参考文献10致 谢11附 录12前言土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanic
6、um）是寄生于牛、羊等多种动物门静脉和肠系膜静脉的一种血吸虫。它与所在属内的其它血吸虫导致的疾病称为东毕吸虫病，主要分布于亚洲和欧洲的一些地区，常呈地方性流行，对畜牧业危害十分严重1-5。其尾蚴可引起人的尾蚴性皮炎（也称稻田皮炎），是北方尾蚴皮炎病原之一6-7。目前，关于东毕吸虫的分类主要基于成虫和虫卵形态特征、中间宿主特异性、尾蚴逸出周期性、潜伏期、产卵量、致病性和免疫性以及地理分布等传统的分类方法，但传统的分类不能全面地反映血吸虫种系发生的遗传变异关系。近年来，随着PCR技术及现代分子生物学技术的发展，为寄生虫的分类及研究虫种间的进化关系提供了新的研究方向和研究方法。因此，本研究选用黑龙江
7、省大庆地区牛体内分离的土耳其斯坦东毕吸虫，PCR扩增28S 核糖体大亚基LSU序列（28S LSU）并构建进化树，讨论其系统发生情况，为今后研究土耳其斯坦东毕吸虫的分类、起源和裂体科血吸虫的系统发生奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 虫体来源 剖检自然感染东毕吸虫病的黄牛，于肠系膜静脉中挑取虫体，经形态学鉴定为土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum Skrjabin, 1913; Dutt et Srivostava, 1955）8-9，生理盐水冲洗，70%乙醇保存。1.1.2 引物检索GenBank相关序列，应用Oligo 6.0软件
8、设计引物。上游：5-TATCACTAAGCGGAGGAAAAGA-3下游：5-AGGGAACCAGCTACTACTAGATGG-3由上海生工生物工程有限公司合成。1.1.3 菌株 大肠杆菌JM109由黑龙江八一农垦大学动物科技学院寄生虫研究室保存。1.1.4生化试剂以及试剂盒La TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、DNA Marker（2000）、pMD18-T载体购自TaKaRa公司，限制性内切酶Sac、Hind购自Fermentas公司，蛋白酶K购自德国Merck公司，琼脂糖购自OXOID公司, Biospin胶回收试剂盒购自Bioer Technology公司。1.1.5 试
9、验试剂 DNA裂解液，电泳缓冲液，氨苄青霉素，IPTG，X-Gal，LB平板，氨苄青霉素LB平板，SOC培养基，含氨苄青霉素的LB液体培养基，质粒提取溶液，琼脂糖凝胶，JM109感受态细胞（以上试剂的配制见附录1），蛋白酶K，琼脂糖，EDTA，Tris碱，SDS，Tris-平衡酚，氯仿，异戊醇，甘油，冰醋酸，葡萄糖，氢氧化钠，醋酸钠。1.1.6 主要仪器设备Gel Doc 2 000紫外凝胶成像分析系统，美国Bio-RAD；PCR仪，Thermo electron corporation；D3752型高速台式离心机，Kendro laboratory公司； HZQ-C型空气浴振荡器，哈尔滨市东
10、明医疗仪器厂；Hws24型恒温水浴锅，上海恒科仪器有限公司；HX-150型恒温循环仪，北京德天佑科技发展有限公司；微波炉，青岛海尔制品有限公司；电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；天平，上海精密科学仪器有限公司；水浴摇床HZS-H，中国哈尔滨市东连电子技术有限公司；超低温冰箱R-134AREVCO ；可调式恒温水浴箱，北京德天佑科技发展有限公司；漩涡振荡器XW-80A，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电热恒温培养箱（DGG-9 620A），宁波自动化仪表厂；超净工作台。1.2 试验方法1.2.1 总DNA的提取1.2.1.1 虫体材料的处理将保存在70%酒精中的土耳其斯坦东毕吸虫取出，置
11、于1.5 mL离心管中，加去离子水反复冲洗3次，吸干去离子水。加入280 L的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再加入20 L （25 g/L）的蛋白酶K，混匀后，置于恒温箱中，37作用12 h，其间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。1.2.1.2 虫体DNA的抽提将裂解虫体后的溶液置于新的1.5 mL离心管中，加入Tris-平衡酚300L，缓慢颠倒46次后，于12 000 r/min离心10 min，并取其上清液于另一离心管中。向上清液中加入酚氯仿异戊醇（体积比为25241）300 L，缓慢颠倒46次后，于12 000 r/min离心10 min，并取上清液于另一离心管中。向上清液中加入氯仿30
12、0 L缓慢颠倒46次后，于12 000 r/min离心10 min，并取上清液于另一离心管中。向上清液中加入800 L预冷的无水乙醇，缓慢颠倒46次，置于-201 h后，于12 000 r/min离心15 min，弃去上清液，向离心管中加入预冷的70%乙醇600 L，反复清洗3次，在37恒温箱内干燥约10 min。取出离心管，并向其内加入50 L去离子水漩涡震荡以溶解DNA。1.2.2 28S-LSU基因组的扩增进行PCR加样时均在冰上操作，PCR反应体系见表1。PCR反应条件为95预变性10 min；95 1 min，52 1 min，721.5 min，共30个循环；最后72延伸10 mi
13、n，产物4保存。表1 PCR反应体系试剂体积（l）La Taq Buffer2.5dNTP2上游引物0.5下游引物0.5模板DNA0.5La Taq酶0.2加去离子水补至25L 取PCR扩增产物2 l，与适量的6Loading Buffer混匀，然后用取液器将样品加入1%琼脂糖凝胶中，同时加入DNA Marker。接通电极，使DNA向阳极移动，在150V进行电泳。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。将电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察，并使用凝胶成像系统进行照相。1.2.3 目的基因胶回收 参照Biospin胶回收试剂盒的说明书（见附录）进行胶回收。1.2.4 目
14、的基因的克隆1.2.4.1 胶回收产物的连接连接反应体系如下： Ligation Mix 5 L 目的片断 2.3 LpMD 18-T Vector 0.7 L 加去离子水至10 L，混匀后于16连接过夜。1.2.4.2 连接产物的转化 从-80中取出JM109感受态细胞，室温使其融化；SOC培养基、氨苄青霉素LB平板于37恒温箱预热。取100 L JM109感受态细胞于灭菌离心管中，加入5 L连接产物，吹打均匀后，将离心管放置在冰水浴中30 min，然后进行热水浴90 s，再放置在冰水浴中5 min，最后加入890 L SOC，放置在摇床中200 r/min 1 h。取培养后的菌液，离心后，
15、去上清，保留约200 L，反复吹匀使菌体悬浮，吸取全部液体，涂布于氨苄青霉素LB平板上，静置10 min，使液体被培养板吸收，均在无菌条件下操作，平皿倒置于37 恒温箱中培养16 h。1.2.5 质粒DNA的提取取出培养的平皿，观察有无单菌落生长。在超净工作台上，用灭菌牙签挑取10个单菌落，分别置于含有5 mL 加氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，并对试管进行编号为110号，将试管于摇床中37，150 r/min培养过夜。SDS碱裂解法提取质粒DNA：取出含菌液的试管，分别吸取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，于10 000 r/min离心1 min后，弃上清液后分别加入100 L Sol
16、ution，漩涡震荡后加入200 L Solution，缓慢颠倒数次，加入150 L Solution，缓慢颠倒，于12 000 r/min离心10 min，取上清液于新的离心管中，分别加入等体积的酚氯仿异戊醇（体积比为25241）溶液，颠倒46次后，于12 000 r/min离心10 min，取上清液于新的离心管中，加入1 mL预冷的无水乙醇，反复颠倒几次后置于-20沉淀30 min，于12 000 r/min离心10 min，弃上清液并将剩余乙醇弃去，用75%乙醇清洗一次，反复颠倒后离心并弃上清液，室温干燥后加入50 L 含RNA酶的去离子水，37孵育10 min，-20保存，以备做鉴定。
17、1.2.6 质粒DNA的鉴定1.2.6.1 酶切鉴定酶切鉴定采用两种限制性内切酶Hind和Sac对提取的质粒DNA进行双酶切，反应体系为10 L，见表2。反应条件为37水浴3 h。表2 酶切反应体系（10L）试剂体积（L）R Buffer1Hind0.5Sac0.5质粒DNA5加去离子水补至10 L取酶切产物2 L进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳好的琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察，并使用凝胶成像系统进行照相。1.2.6.2 PCR鉴定 质粒DNA进行PCR鉴定，条件与1.2.2相同，产物进行琼脂糖凝胶电泳。1.2.7 目的基因的测序鉴定为阳性的重组菌加甘油，送至北京英骏公司测序。1.2.8 比对分析与进
18、化树的构建从GenBank上选取相关血吸虫基因，另选取肝片形吸虫作为外群，相关基因见表3，应用MEGA 3.1软件构建土耳其斯坦东毕吸虫28S-LSU进化树。表3 GenBank上选取相关吸虫基因所选吸虫基因登陆号Fasciola hepaticaAY222244Schistosoma bovis 28SAY157266Schistosoma intercalatum 28SDQ354362Schistosoma curassoni 28SAY157264Schistosoma haematobium 28SZ46521Schistosoma leiperi 28SAY157261Schist
19、osoma margrebowie 28SAY157260Schistosoma rodhaini 28SAY157256Schistosoma mansoni 28SZ46503Schistosoma edwardiense 28SAY197342 结果2.1 28S LSU序列的扩增琼脂糖凝胶电泳显示，在 1 300 bp处看到清晰条带，与预期目的片段大小相符，用凝胶成像系统照像（见图1）。1000 bp1M2000 bp2图1牛源土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列PCR扩增M：DNA分子质量标准；1：28S LSU；2：阴性对照Fig. 1 Agarose gel electropho
20、resis of 28S LSU PCR products of O. turkestanicum samples from cattle.M: DL2000 DNA marker. Lanes 1: 28S LSU PCR products; 2: Negative control 2.2 重组质粒DNA的鉴定以黄牛源土耳其斯坦东毕吸虫核糖体28S LSU序列阳性质粒为模板，以特异性引物进行PCR鉴定和双酶切鉴定。PCR鉴定产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，可见1 300 bp左右的条带（图2）；双酶切产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，可见被切为线性的pMD18- T载体和1 300 bp左右的条带
21、（图3），均与预期目的片段相符。图3 牛源土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列酶切鉴定M：DNA分子质量标准；1：28S LSUFig. 3 Agarose gel electrophoresis of identification of pMD18-T-28S-LSU recombinant plasmids by restrict enzymes of O. turkestanicum samples from cattle.M: DL2000 DNA marker. Lanes 1: 28S LSU products by restrict enzymes1被切成线形的T载体2000 b
22、p1000 bpM目的片断图2 牛源土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列PCR鉴定M：DNA分子质量标准；1：28S LSU Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of identification of pMD18-T-28S-LSU recombinant plasmids PCR products of O. turkestanicum samples from cattle.M: DL2000 DNA marker. Lanes 1: 28S LSU PCR products1000 bp2000 bp1M 2.3 目的基因测序结果测序结果显示，土耳其斯
23、坦东毕吸虫28S LSU序列大小为1 304 bp。测序结果见图4。1 tatcactaag cggaggaaaa gaaactaaca aggattccct tagtaactgc gagtgaacag 61 ggattagccc aacaccgaag cctgcggttg tttgatcgtg aggcaatgtg gtgtttaggt 121 tggcttctgg cattactgct cttccccaag tccagcaatg agtacggctt cccattctgg 181 cccatagagg gtgaaaggcc cgtgggggta gagaccaagt gtgacagttc
24、tgctcagagc 241 tccccttaga gtcgggttgt ttgtgaatgc agcccaaagt gggtggtaga ctccatccaa 301 ggctaaatac ttacacgagt ccgatagcaa acaagtaccg tgagggaaag ttgaaaagta 361 ctttgaagag ggagtaaaca gtgcgtgaaa ccgctcaaag gtaaacgggt ggagttgaac 421 tgcaagccct gggaattcag ctgatgagtg tgatttgtgc ttgggcatac tggccgcctt 481 cagtg
25、tccgt ttaaccgcgg gtgcctgcct tatcggtggg tgtgtgtgaa tcgtttgcaa 541 gcgacgcacg cactgttggt gtgagggtct gcttgtcagt gcactttctc agggtgttca 601 ccacgaccgg cgctgctgcc tgtctgctat gatcaaactg gtcgagtctg gcattgttgg 661 gcttggctgg gtcggcaggt gactctttgg ctcattcgtg ggccgtgagt gttactagct 721 ggttgtagtg gatctgtgcg gtg
26、tgtcgga gatggcggct tcgcatgcgt gcttagacct 781 gcggacattg ttgagtctgg tcggtttgtt actggcttcg gctggtcggc tgatggcttg 841 attttgttgc gttggcagtt gcgtgtgtga acggcttggg cccatagtct gtggtgtagt 901 ggtagacgat ccacctgacc cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtttaac atgtgcgcga 961 gtcattgggt gttacgaaac ccaaaggcga agtgaaggta a
27、aggttcggc ttgtccgggc 1021 tgaggtgaga tcctgctgtc ttgctcatac tttccaagtt gcgagcagtg ggcgcatcac 1081 cggcccgtcc catgacgtag acatgtgacc ttgcgttgcg tgcaccgtcg gggcggagca 1141 agagcgtaca cgttgaggcc cgaaagatgg tgaactatgc ttgcgaaggt tgaagccaga 1201 ggaaactctg gtggaggacc gtagcgattc tgacgtgcaa atcgatcgta taacgt
28、gagt 1261 ataggggcga aagactaatc gaaccatcta gtagctggtt ccct图4 28S LSU序列测序结果Fig 4 The sequenced results of 28S LSU2.4 基于土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列构建的进化树使用Clustal X 1.83软件对土耳其斯坦东毕吸虫及相关血吸虫的28S LSU序列进行序列比对，提交引导树；利用MEGA软件以邻接法（Neighbor-Joining，NJ法）构建土耳其斯坦东毕吸虫进化树，通过自引导获得系统树分支的置信度（重复次数为3 000次），构建时以肝片形吸虫（Fasciola hep
29、atica）的28S LSU序列作为外群，以获取系统树的根（图5）。图5 基于土耳其斯坦东毕吸虫28S LSU序列构建的进化树Fig. 5 Phylogenetic relationships of O. turkestanicum with other members of the Schistosomatidae re-constructed by neighbor-joining method based on the 28S LSU gene using Fasciola hepatica as the outgroup. Number at the branch nodes indi
30、cates percentage bootstrap support for 3000 replicates.3 讨论我们选用28S LSU序列作为分子标记研究土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生情况。核糖体DNA是生物体内最保守的基因之一，是细胞核内编码核糖体RNA的基因，为一类中度重复序列，以串联多拷贝的形式存在于细胞核内染色体DNA中，每个重复单位由非转录间隔区、内部转录间隔区和3种核糖体基因编码区（18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA）组成，其中18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA基因组成一个转录元，产生一个前体RNA。28S rDNA具有重要的生物学功能而
31、且在进化过程中比较保守，作为分子标记被广泛应用于多种寄生虫遗传变异、分类、进化等方面的研究。寄生哺乳动物的血吸虫，主要分三个种团。曼氏血吸虫种团包括流行于非洲、南美洲及加勒比地区的4 个虫种：曼氏血吸虫（S. mansoni）、罗氏血吸虫（S. rodhaini）、爱德华血吸虫（S. edwardiense）、河马血吸虫（S. hippopotami），虫卵以侧刺形为主，中间宿主为双脐螺（Biomphalaria spp.）；埃及血吸虫种团包括流行于非洲及邻近地区的7 种血吸虫：埃及血吸虫（S. haematobium）、间插血吸虫（S. intercalatum）、麦氏血吸虫（S. matt
32、heei）、牛血吸虫（S. bovis）、柯拉松血吸虫（S. curassoni）、马格里血吸虫（S. margrebowiei）、莱氏血吸虫（S. leiperi），虫卵以端刺形为主，中间宿主为小泡螺（Bulinus spp.）；日本血吸虫种团包括流行于我国和东南亚的4 种血吸虫：日本血吸虫（S. japonicum）、湄公血吸虫（S. mekongi）、中华血吸虫（S. sinensis）、马来血吸虫（S. malayensis），以圆刺或微刺形虫卵为主，中间宿主为钉螺（Oncom elania） 或拟钉螺（Tricula aperta），小罗伯特螺（Robertsiella）。除以上三个
33、主要种团外，尚有人提及印地血吸虫种团（Schistosoma indicum group），包括印地血吸虫（S. indium ）、棱形血吸虫（S. spindale）、鼻血吸虫（S. nasale）、未明血吸虫（S. ineognitum），虫卵为端刺形，中间宿主为印度扁卷螺（Indoplanorbis），流行于印度次大陆及东南亚10-11。土耳其斯坦东毕吸虫也是一种寄生于哺乳动物的血吸虫。在1929年以前土耳其斯坦东毕吸虫是归属于裂体属的称为土耳其斯坦裂体吸虫，但是在1929年由于其雄虫睾丸数等形态差异被归为鸟毕属，后又被划分为东毕属作为其代表虫种9, 12。通过对血吸虫28S序列构建的进
34、化树研究发现，土耳其斯坦东毕吸虫的发生位置处于裂体属血吸虫中，同时处于非洲血吸虫种群中。这与土耳其斯坦东毕吸虫传统的分类地位不同。研究结果与土耳其斯坦东毕吸虫线粒体基因cox1和nad1构建的进化树结果一致13。4 结论对中国大陆牛源土耳其斯坦东毕吸虫的28S LSU序列进行了PCR扩增，构建了土耳其斯坦东毕吸虫的分子进化树，推断土耳其斯坦东毕吸虫归属于裂体属。 参考文献1 刘铁男, 赵秋红, 于克江, 等. 牛羊东毕吸虫病的防治J. 中国兽医杂志, 2002, 10: 29-30.2 王春仁, 仇建华, 于万才, 等. 土耳其斯坦东毕吸虫在绒山羊中发现J. 黑龙江畜牧兽医, 1992, 2:
35、 21.3 王春仁, 皮宝安, 宋卓, 等. 黑龙江省牛羊东毕吸虫病流行情况与地理分布特征的调查研究J. 动物医学进展, 2002, 121: 91-92.4 邢继兰, 王春仁, 何国声.土耳其斯坦东毕吸虫cDNA文库的构建J. 中国人畜共患病杂志, 2004, 20(7): 637-639.5 魏佳, 何国声, 姚宝安, 东毕吸虫病的研究进展等J. 河北科技师范学院学报学, 2005, 19(1): 70-77.6 白功懋, 刘忠, 刘兆铭. 吉林省稻田皮炎病因的调查研究I. 土耳其斯坦东毕吸虫及其与稻田皮炎的关系C. 一九六三年寄生虫专业学术讨论会论文摘要集汇编, 1963. 167-16
36、8.7 李志华, 李春礼. 黑龙江省稻田皮炎病因学的研究C. 全国家畜寄生虫病科研工作第二次会议论文摘要文集, 1980, 129-130.8 Skrjabin KI. Schistosoma turkestanicum nov. sp. ein neuer parasit des Rindes aus Russisch, TurkestanJ. Ztschr Infektionskr u Haus tier, 1913, 13: 457-468.9 Dutt SC, Srivastava HD. A revision of the genus Ornithobilharzia Odhner,
37、 1912 (Trematoda: Schistosomatidae)M. Proc. 42nd Sci. Conger, 1955, 3: 285.10 Rollinson D, Simpson AJG. The biology of Schistosomes: from genes to latrinesM London U. K. A cademic Press, 1987: 1-49.11 赵慰先, 高淑芬主编. 实用血吸虫病学M. 第1 版. 北京: 人民卫生出版社, 1996: 3-20.12 Price EW. A synopsis of the trematode family
38、 schistosomatidae with descriptions of new genera and speciesJ. Proc. U. S. Nat. mus. Wash. 1929, 75(3): 1-39.13 Li L, Yu LY, Zhu XQ, et al. Orientobilharzia turkestanicum is grouped within African schistosomes based on phylogenetic analyses using sequences of mitochondrial genesJ. Parasitol Res, 20
39、08, 102(5): 939-943.致 谢本课题是在黑龙江*附录1主要试剂及其配制1、DNA裂解液：0.5 mol/L NaCl 70 L；0.1 mol/L Tris-HCl （pH8.0） 30 L；0.05 mol/L EDTA （pH8.0） 150 L；10% SDS 30 L；蛋白酶K （20 mg/L） 20 L。其中NaCl、Tris-HCl、EDTA 经过高压灭菌。所配溶液均使用去离子水。2、电泳缓冲液50Tris-乙酸（TAE）：成份及终浓度（配制1 L溶液各成份的用量）为2 mol/L Tris-碱：242 g；1 mol/L 冰醋酸：57.1 mL；100 mmol
40、/L EDTA：100 mL 0.5 mol/L （pH 8.0）。3、氨苄青霉素（Amp）：贮存液，将1 g 氨苄青霉素溶解于10 mL 蒸馏水中，终浓度为100 mg/mL，用0.22 m 滤膜过滤除菌，分装，-20储存备用。4、IPTG：溶解250 mg的IPGT（异丙基硫代-D-半乳糖苷）于10 mL水中，分成小份贮存于-20。5、X-gal：Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：溶解25 mg的Xgal于1mL的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20。6、LB平板：称取1%（W/V）蛋白胨2 g、0.5%（W/V）酵母提取物1 g、1%（W/V）NaCl 2
41、 g、1.5%（W/V）琼脂粉3 g 加去离子水将培养基定溶至200 mL，漩涡震荡器溶解后，滴加5 mol/L NaOH（约0.2 mL），调节pH值至7.0，高温高压灭菌，4保存。7、含氨苄青霉素/IPTG/X-gal的LB平板：按正常程序制备氨苄青霉素平板时，补加IPTG和X-gal至终浓度的0.5 mM IPTG和80 mg/mL X-gal,而后倒出培养基、铺制平板，另一种方法是在使用前将100 L的100 mM IPTG和20 uL的50 mg/mL X-gal涂到氨苄青霉素平板的表面上，并在37孵育30 min使之吸收后使用。 8、SOC培养基（100mL）：将胰蛋白胨（1M，2
42、.0 g）、酵母抽提物（1M，0.5 g）、NaCl（0.05845 g）及KCl（1 mol/L，0.01864 g）加到97 mL的去离子水中，搅拌使之溶解。高压灭菌并冷却到室温。加入2M Mg2+母液（0.4066 g）和2M葡萄糖（0.36032 g）至终浓度20 mM，补加消毒毒蒸馏水至100 mL，完全培养基用0.2 m的滤膜过滤灭菌，最终浓度pH值为7.0。9、含氨苄青霉素的LB液体培养基：先制备LB液体培养基,取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，加入1 000 mL蒸馏水中，用5 M NaOH调pH为7.5，高压灭菌20 min，待温度降至50加入氨苄青霉
43、素，配成终浓度为100 L/mL。10、质粒提取溶液：（1） Solution：50 mmol/L Glucose,25mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），10 mmol/L EDTA（pH值8.0）。（2） Solution：0.2 mmol/L NaOH（临用前用10 mmol/L贮存液现用现稀释），1%SDS（临用前用10%贮存液现用现稀释）。（3） Solution：3 mmol/L KAc,5 mmol/L HAc。11、蛋白酶K：将200 mg的蛋白酶L加入到9.5 mL水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10 mL，然后分装成小份贮存于-20
44、。12、葡萄糖灭菌：流通蒸汽灭菌。13、琼脂糖凝胶：配制1%琼脂糖凝胶，准确称取1 g琼脂糖加入至100 mL 1TAE电泳缓冲液，于微波炉中熔化均匀，冷却至50左右，加入溴化乙锭（EB）（10 mg/mL,加入量为8.3 L EB/100 mL琼脂糖凝胶液），混匀后倒入已封好的凝胶灌制胶膜中，插上样品梳。待胶凝固后，从胶膜上除去封带，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入足够量的电泳缓冲液（要求缓冲液液面高出凝胶表面约1 mm）。14、JM109感受态细胞：JM109工程大肠杆菌由本实验室保存于-80，试验时取出，室温待其融化，用接菌环蘸取一下，在LB固体平板上划线，37过夜。次日，基因工程菌的一级培养：挑取一个JM109单菌落接种到一个装有6 mL LB培养基的试管中，至于恒温摇床中（37，150 r/min）培养过夜；基因工程二级培养：在150 mL新鲜LB培养基中加入3 mL JM109二级培养物，于恒温摇床中（37，200 r/min）培养2.75小时，OD值0.4左右。菌液呈云雾状，然后于冰浴中预冷30min；将预冷的JM109二级培养物离心8 000 r/min 10 min。4去上清，加入TSS（JM109二级培养物TSS为45 mL5 mL）。缓慢摇匀，冰上操作，分装每管100 mL，-8
