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1、本科毕业论文（设计）( 2015届 ) 题 目： 有机松萝茶园上中下松萝基地 鲜叶茶氨酸含量测定 学 院： 生命与环境科学学院 专 业： 生物科学 学生姓名： 学号： 指导教师： 职称（学位）： 研究员 合作导师： 职称（学位）： 完成时间： 2015 年 月 日 成 绩： 综合成绩： 等级： 黄山学院教务处制 学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）：年 月 日 目 录摘要英文摘要1引言51.1茶氨酸的性质质51.2茶氨酸的
2、生理功能51.3茶氨酸的制取52材料和方法62.1材料62.2试剂和药品62.3仪器62.4方法62.4.1样液的提取取取62.4.2试剂的配制置72.4.3纸层析法量酸72.4.3.1纸层析步骤72.4.3.2茶氨酸标准曲线制作82.4.3.3茶氨酸样液测定83结果83.1实验数据处理酸83.1.1测定的标准浓度茶氨酸数据及标准曲线线83.1.2上、中、下松萝基地茶氨酸含量测量93.2实验结果分析实验结果分析测104讨论10参考文献10致谢11 有机松萝茶园上中下松萝基地鲜叶茶氨酸含量测定刘动斌 （21109041028）导师：吴卫国（研究员）（黄山学院生命与环境科学学院，）摘要：本实验分别
3、从有机松萝茶园上中下松萝基地鲜叶中提取茶氨酸,并用纸层析的方法进行测定不同松萝基地鲜叶中茶氨酸的含量,为从松萝茶中提取茶氨酸生物源提供依据。实验结果显示松萝基地鲜叶茶氨酸含量是：上松萝下松萝中松萝。关键词：纸层析法；茶氨酸；松萝基地；鲜叶；含量Usnea Organic Tea Garden 3 Usnea Base Fresh Leaves Theanine Content DeterminationDong-bin LIU（21109041028）Supervisor: Wei-Guo WU (Researcher)(College of Life and Environment scie
4、nces, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)Abstract: This experiment respectively from usnea organic tea garden 3 fresh leaf extract l-theanine usnea base, and paper chromatography method to determine the content of different fresh Ye Zhongcha glycine usnea base, to extract l-theanine from
5、usnea tea biological source provides the basis.Experimental. Results showed that the content of fresh leaves theanine usnea base in on usnea is more than under usnea ,And fresh leaves usnea base usnea theanine content is the lowest.Key Words: Paper chromatography.Theanine;Usnea base;Fresh leaves.con
6、tent1. 引言1.1 茶氨酸的性质茶在英国人是：健康之液，灵魂之饮。在中国被誉为“国饮”。 茶在我国具有几千年的历史。茶之所以一直作为我国特有的饮料，在于它不仅仅具有独特的风味，而且还具有保健的作用和医药的效果。现代科学大量的研究已经证实，茶叶中确实含有与人体的健康所密切相关的生化成份，茶叶中所具有药理作用的主要成份是脂多糖、茶氨酸、茶多酚、咖啡碱等。在此之中，茶树中的茶氨酸在其中起到了主要的作用。茶氨酸是茶叶中所特有的游离氨基酸，茶氨酸的含量因茶的品种、部位而变动，直接决定茶叶的品质。是由日本学者酒户弥二郎首次从茶叶中提取出并对命名。茶氨酸是茶树中一种特殊的氨基酸，茶树中茶氨酸的含量直接
7、影响着茶的香甜清爽的口味。迄今为止人们在茶叶中已经发现25 种氨基酸（赵丹，2002）。茶叶中的多酚类及其衍生物、氨基酸、维生素、咖啡碱等成分对松萝茶的风味、品质及其功效有较明显的影响。其中，又以茶叶中的特征氨基酸茶氨酸关系最为密切。在已发现的氨基酸中，以茶氨酸的含量最高，约占到茶叶中游离氨基酸的总量的50%以上（吕毅，2003）。1.2 茶氨酸的生理功能茶氨酸是一种安全、无毒、具有多种生理功能的天然食品添加剂，它不仅易溶于水，还可抑制苦味物质，改善食品的风味，茶氨酸作为茶叶的主要呈味物质，常被作为食品添加剂用于茶饮料中。茶氨酸还可以用于各种各样的糖果、点心、饮料、果冻以及口香糖等食品中，并且
8、在添加茶氨酸后，不会引起食品的品质下降。此外，茶氨酸还有很多生理功能，如降血压作用（陈宗懋，1997）、抗肿瘤作用（Sadzuka Y，1998）、静心安神作用（Tsunoda T ，1993）、促进大脑功能和抗疲劳作用等（朱松，2005）1.3 茶氨酸的制取随着茶氨酸的保健作用和医药疗效得到科学家的验证，市场对茶氨酸的需求也在不断上升，研究人员从茶树中提出茶氨酸的技术也在不断增多。目前，存在着两种制取渠道。一种渠道是从茶叶中直接提出、分离纯化茶氨酸，是最直接、有效的生产途径，存在的方法有沉淀法、纸层析法（马雪泷，2012）、离子交换树脂法、高效液相法等。此方法的优点是纯度高，但成本较高，更适
9、用于实验室做研究之用。另一种方法是用合成渠道制取茶氨酸，存在的方法主要有化学合成法（Israe Li， 1995）、微生物发酵法（李平，2004）和植物组织培养法（Orihara Y， 1990）。此种渠道更易应用于茶氨酸的大量生产。本实验以安徽休宁县3个不同地理位置的松萝茶基地的松萝茶为研究对象，采用纸层析法进行茶氨酸的检测分析，旨在筛选出高茶氨酸品种，同时对不同区域间茶氨酸含量进行分析，了解不同区域间松萝茶的茶氨酸含量差异，为今后茶树资源理论研究和品种选育工作提供借鉴。2.材料与方法2.1 材料有机松萝茶园松萝基地鲜叶（上中下），层析纸 2.2 试剂和药品磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、99%的茚
10、三酮、氯化亚锡、99.9%酒精、茶氨酸标样、茶氨酸标准液、蒸馏水2.3 仪器722N可见分光光度计、100ml容量瓶、25ml容量瓶、移液管、胶头滴管、烧杯、水浴锅、4000r/min离心机、电热恒温干燥箱、冰箱、吹风机、PH计、分析天平（ 精确度0.0001 g ）等2.4 方法2.4.1 样液的提取1，将松萝基地上中下松萝鲜叶分别置于55电热恒温干燥箱中烘干24小时，直至茶树老根和幼根重量为恒重。烘干后放入研磨机研磨成粉末分别放入冰箱冷藏室备用。2，浸提：取上松萝、中松萝、下松萝各1g分别放入烧杯中并加入蒸馏水60ml置于沸水浴中浸提45min（每隔10min搅拌一次），以保证水浴彻底。3
11、，冷却：水浴完成后，取出烧杯冷却至室温。4，离心：分别将上中下松萝样液转移至10ml离心管，保证每个离心管的质量相同并对称装于离心机中，完成后采用4000r/min离心机离心5min。5，过滤：分别将各离心上清液进行过滤，并且将滤液定容到100ml容量瓶中，贴上标签后转移到冰箱保鲜柜备用。 2.4.2 试剂的配制 茶氨酸标准样液（1ml含茶氨酸1mg）：准确称取100mg茶氨酸粉末（纯度不低于99%）充分溶于100ml蒸馏水中，作为标准样液。茶氨酸工作液（1ml含谷氨酸0.1mg）：准确吸取5ml茶氨酸标准样液，加蒸馏水定容至50ml，作为茶氨酸工作液。磷酸缓冲液（PH8.0）：1/15mol
12、/L磷酸氢二钠溶液：称取23.877g磷酸氢二钠，加蒸馏水溶解完全后定容至1L，即a溶液；1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称取9.037g磷酸二氢钾固体，加蒸馏水溶解完全后定容至1L，即b溶液；取a溶液95ml和b溶液5ml，混合均匀。2%茚三酮溶液（谭和平等，2007）：准确称取99%的茚三酮0.200g加5ml蒸馏水待其完全溶解后，再加入0.008g氯化亚锡，搅拌均匀，静置24小时后过滤定容至10ml，然后储存在棕色容量瓶中低温避光保存备用（不超过3天）。展层剂：80%酒精：取75ml100%酒精加蒸馏水定容至100ml；取20ml2%茚三酮溶液，用75%酒精溶液定容至100ml。洗脱剂
13、：60%乙醇：准确量取60ml100%乙醇加蒸馏水定容至100ml，即得到洗脱剂。2.4.3 纸层析法2.4.3.1纸层析步骤 1，制备层析纸：将层析纸裁剪成20cm20cm纸样，注意裁剪过程中避免手指皮肤与层析纸接触（茚三酮与蛋白质反应生成紫色产物，污染层析纸），使用手套进行裁剪。裁剪完成后，在距离层析纸上下边缘1.5cm处用铅笔做标记，在标记点处点样，点与点之间的距离不小于2cm。2，点样：用20ul毛细滴管准确吸取样液并进行点样，为了是样点干燥迅速可使用吹风机烘干，每次待样点干燥后在进行下一滴点样，为了保证实验的准确，每滴样液控制在0.5mm以内。每个样点依次点取10ul、20ul、30
14、ul、40ul、50ul，其作为茶氨酸标准曲线样点。3，层析：向玻璃皿中倒入一定量的展层剂，将准确点样完成后的层析纸竖直放入玻璃皿中进行跑带。依据展层剂渗入层析纸2/3作为标准，停止跑带。跑带完成后，将层析纸放入60干燥箱处理10min。4，洗脱：将层析纸各样点对应的紫色部分以2cm2cm大小的标样裁剪放入洗脱剂中进行充分洗脱。5，测量吸光度：将722N可见分光光度计调至575nm进行各样液测量。2.4.3.2茶氨酸标准曲线制作 按照2.4.3.1进行测定，按照标准浓度梯度顺序进行加样，以吸光度值为横坐标，以茶氨酸含量为纵坐标作图，绘出茶氨酸标准曲线。2.4.3.3茶氨酸样液测定 由2.4.3
15、.1根据各个点样、剪裁、洗脱、测量，根据测量所得吸光度值以及所对应的茶氨酸含量。以吸光度值为横坐标，茶氨酸含量为纵坐标绘制出茶氨酸标准曲线，并求出线性方程。利用标准曲线，进行样液吸光度测定，根据吸光度可求出样液中茶氨酸含量。3 结果 3.1实验数据处理3.1.1测定的标准浓度茶氨酸数据及标准曲线表3-1标准梯度浓度测定数据体积（ul）203040506070茶氨酸（mg）0.0020.0030.0040.0050.0060.007OD值(mAU)0.0070.0180.0250.0340.0460.061 图3-1茶氨酸标准曲线图注：横轴为OD值，单位mAU；纵轴为质量，单位mg3.1.2 上
16、、中、下松萝基地茶氨酸含量测量将冰箱中上、中、下号基地溶液取出，根据上述纸层析法进行点样，在样点处用铅笔标记上、中、下，分别用上、中、下号基地之前所配制成的溶液点样，每一个点点样20ul，进行两次点样，进行上述同样的展层、洗脱、测量吸光度，取两次吸光度的平均值，将测得的平均吸光度值分别代入上述茶氨酸标准曲线的线性方程中得出茶氨酸质量。表3-2 松萝基地茶氨酸含量测量情况一览表松萝有机茶园6号基地7号基地8号基地特点山上山上山上经度11811.17711811.243纬度2952.0872952.006高度631m567m第一次点样OD0.02300.01200.0190第二次点样OD0.026
17、00.01100.0200平均值0.02450.01150.0195茶氨酸量（mg）0.0038034330.0025686280.0033285083.2 实验结果分析1、纬度影响着茶树的日照程度，海拔则影响着茶树生长的温度。我们可以了解经度影响茶氨酸含量的程度，经度越高茶氨酸含量越低；茶树所处的高度就越强越高其受太阳光照程度越大。2、本次实验中存在的问题： （1）在本实验中采用纸层析制作茶氨酸标准曲线，前期需进行大量重复实验确保R平方无线趋近0.9999。选取大量实验中较为理想的一次：R2=0.9851，但是实际数据与趋势线的估计值的拟合程度仍旧不高。 （2）茶氨酸在层析纸上的条带有明显的
18、拖尾现象。造成这些结果的原因有以下几点：实验重复次数不够、点样过程中某些样点的半径过大、使用吹风机型号不同导致风速温度等不同、个别样液未完全干燥便继续点样、点样不认真，态度不端正等。4 讨论本实验目的是测定有机松萝茶园上中下松萝基地鲜叶茶氨酸含量测定。从上述表格数据分析可得：有机松萝茶园上中下松萝基地鲜叶茶氨酸含量中上松萝含量最高，下松萝次之，中松萝最少，与预计大致相符合。我们可以了解经度影响茶氨酸含量的程度，经度越高茶氨酸含量越低；茶树所处的高度就越强越高其受太阳光照程度越大，6、8号基地的茶氨酸含量较低海拔的7号基地高，茶树处在公路边还是山上对茶氨酸含量并无什么影响。实验过程中，茚三酮的配
19、制和保存是关键，本实验从试验材料的准备，到试验前准备以及试验的过程和试验后数据的处理都充分显示了试验的准确性、条件的重要性和数据的严密性。每一步实验都要严谨认真，才能保证实验结果最大的接近正确率。参考文献陈宗懋. 茶氨酸具有降压功能 J . 中国茶叶, 1997, ( 2) : 27-31.李平，宛晓春，张正竹。生物合成茶氨酸的研究进展及构建基因工程菌合成茶氨酸的可行性探讨J。食品与发酵工业，2004，30( 1)：71-75吕毅,郭雯飞,倪捷儿,杨贤强. 茶氨酸的生理作用及合成J. 茶叶科学,2003,01:1-5.马雪泷,邹鹏飞,王荡强,曹顺利,房江育,王昶. 纸层析-分光光度法检测茶氨酸
20、J. 植物生理学报,2012,04:413-417.赵丹, 王朝旭. 茶氨酸的国内外研究现状J. 食品科学, 2002, 23(5):146-147.朱松, 王洪新. 茶氨酸的生理功能及在食品中的应用J. 食品研究与开发, 2005, 26(3): 18-20.Method for producing theanineJ.Israeli,1995,23:768OriharaY.Production of theanine and other gamma-glutamyl derivateives by Camellia sinensis culturalcellsJ.BA,1990:10218
21、Sadzuka Y, et al . Modulation of cancer chemotherapy by green tea. Clin Cancer Res, 1998( Jan) , 4( 1) : 153 156TsunodaT, MatsuraT,et al. Theanine for inhibition of the stimulation induced by caffeine and manufacture or preparation of theanin J.CA,1993,118(5):3792-3793致谢本实验即将接近尾声，回望过去，实验室的仪器声和讨论声依然回荡脑海。在这段时间里，我不仅充实了自己的知识，也锻炼了自己的动手操作能力。时光飞逝，转眼间大学四年时光即将过去，回顾四年以来的大学学习和生活的场景依然历历在目在这四年中，老师的谆谆教导、同学的互帮互助使我在专业技术和为人处事方面都得到了很大的提高。感谢黄山学院在我四年的大学生活当中对我的教育与培养，感谢黄山学院生命与环境科学学院的所有专业老师，没有你们的辛勤劳动，就没有我们今日的满载而归，感谢大学四年曾经帮助过我的所有同学。
