红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析.doc

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1、园 艺 学 报 2014，41（6）：11831190 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140121；修回日期：20140410 基金项目：国家自然科学基金项目（31201593） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenxs；Tel：0538-8249338） 红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析 孙莎莎，王 楠，冀晓昊，冯守千*，张宪省，吴树敬，李 敏，王延玲，陈学森* （山东农业大学园艺科学与工程学院，作

2、物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018） 摘 要：以红皮梨奥冠为试材，采用RT-PCR结合RACE技术获得1个MYB基因，命名为PyMYBa。该基因开放读码框共714 bp，编码237个氨基酸。PyMYBa分子量27.4 kD，等电点8.78。氨基酸序列分析显示，在其N端具有保守的R2R3-MYB结构域，R3-MYB结构域含有bHLH结合基序。进化树分析表明，PyMYBa与花青苷调控MYB转录因子的同源性很高。基因表达结果表明，PyMYBa在梨叶、花、果皮中表达量明显高于果肉，果皮中的表达量与花青苷调控基因PyMYB10相比，无显著差异。遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMY

3、B10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似，推测PyMYBa为梨花青苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测结果与预期蛋白分子量一致。 关键词：梨；花青苷；PyMYBa 中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1183-08 Cloning and Expression Analysis of an Anthocyanin-related Transcription Factor Gene PyMYBa in Pear SUN Sha-sha，WANG Nan，JI Xiao-hao，FEN

4、G Shou-qian*，ZHANG Xian-sheng，WU Shu-jing，LI Min，WANG Yan-ling，and CHEN Xue-sen* （College of Horticulture Science and Engineering，State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018，China） Abstract：The 714 bp full length cDNA of PyMYBa gene was obtained using

5、RT and RACE PCR from pear skins. The predicted protein of PyMYBa had 237 amino acids，with a calculated molecular mass of 27.4 kD and an isoelectric point of 8.78. The conserved R2R3 domain was observed in the N-amino terminus of PyMYBa. A signature motif specific for the interaction between MYB and

6、bHLH proteins was observed in the R3 domain. Phylogenetic analysis revealed that PyMYBa is close with other MYB TFs involved in anthocyanin biosynthesis. Transcription analyses revealed that higher transcript levels of PyMYBa were in flower，leaf，fruit peel than in fruit flesh. In pear skins，the simi

7、lar transcripts of PyMYBa and PyMYB10 were detected. The expression level of PyMYBa is highly correlated with the concentration 1184 园 艺 学 报 41卷 of anthocyanin in peel after shading treatment and MeJA treatment. Therefore，the PyMYBa is speculated to be a positive MYB transcription factor gene regula

8、ting the biosynthesis of anthocyanin in pear. Through a prokaryotic expression system，the recombinant protein of PyMYBa was obtained，whose molecular weight was consistent with the size of expected protein. Key words：pear；anthocyanin；PyMYBa MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一，其中R2R3-MYB转录因子数量最多，广泛参与植物的生命代谢活动。部分R2R

9、3-MYB基因作为调控基因，参与花青苷的生物合成代谢（Dubos et al.，2010），在植物花青苷合成调控及红色性状形成中起关键作用。MYB转录因子可以独自或与BHLH、WD40形成蛋白复合体调控花青苷结构基因的表达（Grotewold et al.，2000；Hernandez et al.，2004；Gonzalez et al.，2008）。自Paz-Ares等（1987）从玉米中克隆出第1个花青苷调控转录因子基因ZmMYBC1以来，已有数十种花青苷调控MYB转录因子从拟南芥、矮牵牛、金鱼草、葡萄、苹果、茄子等植物中克隆分离（Moyano et al.，1996；Quattrocc

10、hio et al.，1999；Stracke et al.，2001；Kobayashi et al.，2002；Deluc et al.，2006；Espley et al.，2007；邵文婷 等，2013）。 植物花青苷调控MYB转录因子多以家族的形式存在。在拟南芥中存在4个花青苷调控基因PAP1、PAP2、AtMYB113、AtMYB114，它们在花青苷调控中的作用明显不同（Stracke et al.，2001；Gonzalez et al.，2008；Petroni & Tonelli，2011）。在葡萄中存在VvMYBA1、VvMYBA2等多个参与花青苷合成调控的MYB基因，进一

11、步研究发现VvMYBA1或VvMYBA2基因变异均可导致其基因表达量降低，葡萄花青苷调控途径受阻，形成不同白皮葡萄类型（Kobayashi et al.，2004；Walker et al.，2007；Cutanda-Perez et al.，2009）。在苹果中存在两类调控果肉花青苷合成的MYB基因MdMYB10和MdMYB110，它们分别在不同红肉苹果类型中发挥调控作用（Espley et al.，2007；Chagn et al.，2012）。 红皮梨稀少珍贵，与其他红色果实一样，梨果实的红色主要取决于果皮中花青苷的含量（Feng et al.，2010）。目前从梨中已经分离鉴定了一个重

12、要的花青苷调控MYB基因MYB10（Feng et al.，2010；Kui et al.，2010）。但是除MYB10外，梨中是否存在其它重要花青苷调控MYB基因尚不可知。前期，课题组在克隆PyMYB10（Feng et al.，2010）时，获得了另一个MYB转录因子中间片段，经序列比对，其与植物花青苷调控MYB转录因子同源性非常高，因此推测，可能为调控梨花青苷合成新的MYB基因，命名为PyMYBa。在此基础上，本研究中利用RACE-PCR技术获得了该基因的cDNA全长，通过序列比对、进化树及基因表达模式分析推测其具有花青苷调控功能；通过原核表达获得了重组蛋白，这为深入研究其花青苷调控功能

13、及红皮梨育种奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料及处理 试验于2012年在山东农业大学作物与生物学国家重点实验室进行，所用红皮梨品种为奥冠，取自山东省聊城奥冠果业公司基地。MeJA（茉莉酸甲酯）处理：于花后125 d采摘果实，洗净，分别在浓度为2 10-5、2 10-4和2 10-3 mol L-1的MeJA溶液中浸泡15 min，以含0.02%（体积分数）Tween 20和1%（体积分数）乙醇的蒸馏水处理的果实为对照。各处理重复3次，放置在光照培养箱，温度20 ，光照强度22 000 lx，光照周期为光照16 h/黑暗8 h，10 d后取果皮。花后30 d进行奥冠果实套袋，花后13

14、1 d摘袋见光，取摘袋后6 d奥冠的果皮和同一时期套袋奥冠6期 孙莎莎等：红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析 1185 的果皮，比较两者的花青苷含量、PyMYBa与PyMYB10的表达量。于花期（4月15日）采集奥冠刚刚开放的花朵和幼叶，取花后137 d自然生长的奥冠果皮、果肉。上述取样的花朵、幼叶、果皮和果肉立即用液氮处理，80 保存备用。 1.2 总RNA提取与PyMYBa全长克隆 植物总RNA的提取方法参照TianGen RNA plant Reagent说明操作。RNA提取后利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）试剂

15、盒合成cDNA。依据已知植物花青苷调控MYB基因的保守序列设计兼并引物F：5-TGYATHRAYAARTAYGGIGARGGIAARTGG-3，R：5-GTRTTCCAR TARTTYTTIACRTCRTTNGC-3，进行PCR扩增。筛选同源性高的中间片段进行5和3RACE-PCR。扩增3端引物F：5-GCAGGAAAAGCTGCAGACAGAGGTG-3，5端引物R：5-TCTTCCAGCAATTA TTGACCACCTG-3。UPM通用引物由RACE试剂盒提供，根据试剂盒说明进行PCR扩增。扩增序列经分析、拼接后，在两端设计全长特异引物F：5-ATGGAGGATAGTAATTTGCTGG-

16、3，R：5-CTA AATCTTAGTTATCTCTTCTTC-3，获得对应的基因全长。 1.3 PyMYBa生物信息学分析 利用DNAMAN软件进行序列分析，预测目标cDNA编码的蛋白质，将氨基酸序列提交到NCBI上进行BLAST同源序列比对，利用MEGA5.0软件对蛋白序列进行多重比对和进化分析。 1.4 花青苷含量测定 参照王慧聪等（2004）的方法，取0.5 g果皮鲜样，放入10 mL 1% HCl甲醇溶液在4 冰箱中浸提2 h。用分光光度计测定提取液在553 nm和600 nm处的吸光值。以每克果皮鲜质量的提取液的光密度变化值D553 nmD600 nm = 0.01作为1个花青苷单

17、位，以U表示。 1.5 qRT-PCR分析 提取奥冠梨幼叶、花、果皮、果肉的RNA，经DNase消化后利用RevertAid 1st cDNA Synth Kit（Fermentas）反转录为cDNA，作为qRT-PCR模板。按TaKaRa公司SYBR Premix试剂盒说明书操作，以梨Actin（CN938023）作为内参基因。采用iQTM5 software和iQTM5 Real-time PCR System完成荧光定量PCR试验，每个样品进行3次重复。PCR程序为95 30 s；95 5 s，58 35 s，40个循环；95 15 s；60 60 s；95 15 s。反应结束后将数据导

18、出到Excel表中，利用2-Ct公式计算基因的相对表达量（Livak & Schmitten，2001）。应用DPS软件进行显著性差异分析。引物Actin F：5-TCCAGAAGAGCATCCAGTCC-3，R：5-GCCAGGTCCAAACGAAGG-3；PyMYB10 F：5-CAGCAGAAGATTTAAGTACGCCATC-3，R：5-TTCTAACAAGGTCTCCCACCAATC-3；PyMYBa F：5-AACCACGGAGGGCTAGAGTT-3，R：5-GCCTACCATTGTCGATTGTGC-3。 1.6 原核表达 根据PyMYBa的全长序列设计特异引物，获得该基因的开

19、放读码框。将PCR扩增产物双酶切后定向连接到原核表达载体pET-30a BamH和Sal位点上，构建重组表达载体pET-PyMYBa，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。 挑取阳性克隆接种到LB培养液中进行培养，至OD600 0.6时加入IPTG（终浓度分别为0.2、0.8、1.0 mmol L-1）进行诱导表达。诱导2、4、6 h，收集菌体，加入菌液体积10%的SDS-PAGE上样缓冲液，100 煮沸5 min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。对照为加IPTG（终浓度0.8 mmol L-1）诱导4 h的转化pET-30a质粒的BL21菌体蛋白。 1186 园 艺

20、 学 报 41卷 2 结果与分析 2.1 PyMYBa全长克隆与序列分析 根据植物已知花青苷调控MYB转录因子保守区域设计兼并引物，获得一个长度为249 bp的中间片段（图1，A），登录NCBI进行核苷酸序列比对，结果表明该片段与MdMYB10的相似度高达77%，认为该片段为梨MYB基因序列片段。5RACE扩增得到一个长327 bp的片段（图1，B），3RACE扩增得到一个长800 bp的片段（图1，C），两个序列中间有140 bp的重复序列。设计特异引物获得该基因全长，命名为PyMYBa。序列分析表明，PyMYBa开放读码框714 bp（图1，D），编码237个氨基酸，理论分子量为27.4

21、kD，等电点为8.78。推导的氨基酸序列（图2）具有明显的R2R3-MYB 图1 奥冠梨PyMYBa基因的PCR扩增结果 M：DL2000 DNA marker；A：中间片段；B：5端片段；C：3端片段；D：编码区cDNA。 Fig. 1 The PCR amplification results of PyMYBa fromAoguanpear M：DL2000 DNA marker；A：Middle fragment；B：5 terminal fragment；C：3 terminal fragment；D：cDNA coding sequence. 图2 PyMYBa与花青苷调控基因MY

22、B转录因子氨基酸比对 Fig. 2 Comparison of predicted PyMYBa protein sequence with anthocyanin-related MYB proteins of other species 6期 孙莎莎等：红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析 1187 图4 奥冠梨各组织PyMYBa的表达量比较 大、小写字母分别代表1%和5%差异显著水平。下同。 Fig. 4 Analysis of PyMYBa expression in tissues ofAoguanpear Different capital and small lett

23、ers mean significant difference at 1% and 5% level，respecitively. The same below. 图5 奥冠果皮PyMYBa和PyMYB10 表达量比较 Fig. 5 Analysis of PyMYBa and PyMYB10 expression inAoguanpear peel 结构域，在R3-MYB区域有与bHLH互作的结构功能域。在梨基因组网站中（http：/peargenome. 通过NCBI-Blast比对后发现：PyMYBa与植物已知调控花青苷合成的MYB转录因子同源性最高，其中与苹果MdMYB10的一致性为4

24、9%，与梨PyMYB10的一致性为51%。 进化树分析结果（图3）显示：PyMYBa与MdMYB10、AmROSEA1、AtPAP1、PyMYB10等调控花青苷合成的MYB转录因子亲源关系较近，表明PyMYBa可能具有相似的功能。 图3 PyMYBa与其它MYB蛋白系统进化树分析 Fig. 3 Phylogenetic relationship of PyMYBa and other MYBs 2.2 花青苷含量测定及PyMYBa基因表达分析 如图4所示，PyMYBa在富含花青苷的梨叶、花、果皮中的表达量较高，分别约为果肉的55、80、70倍。在果皮中，PyMYBa与梨花青苷调控基因PyMYB

25、10的表达量相比，无显著差异（图5）。遮光明显抑制了果皮中花青苷的合成，遮光处理果皮花青苷含量约为对照的1/5，PyMYBa和PyMYB10表达量分别约为对照的1/10和1/11（图6）。MeJA处理促进果皮中花青苷合成，以2 10-3 mol L-1浓度处理促进作用最为明显，为对照的1.1倍，PyMYBa和PyMYB10的表达量分别约为对照的3倍和2.7倍（图7）。由以上结果可知，遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMYB10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似，表明PyMYBa可能是梨花青苷合成中重要的正向调控因子。 1188 园 艺 学 报 41卷 图6 套袋处理对奥冠梨果皮中

26、花青苷含量、 PyMYBa和PyMYB10表达的影响 Fig. 6 Anthocyanin accumulation，PyMYBa and PyMYB10 expression under bagging and debagging treatments inAoguanpear peel 图7 MeJA处理对奥冠梨果皮花青苷含量、 PyMYBa和PyMYB10表达的影响 Fig. 7 Anthocyanin accumulation，PyMYBa and PyMYB10 expression under MeJA treatment in Aoguanpear peel 2.3 PyMYBa

27、的原核表达与SDS-PAGE分析 构建重组质粒pET-PyMYBa，转化到原核表达宿主菌BL21（DE3）中，加入不同浓度的IPTG，在37 下分别以2、4和6 h进行诱导后，进行SDS-PAGE分析。结果（图8）表明，重组质粒 图8 pET-PyMYBa重组蛋白SDS分析 M：Marker；CK：对照（0.8 mmol L-1 IPTG诱导4 h的pET-PyMYBa）。 Fig. 8 SDS-PAGE analysis for pET-PyMYBa protein M：Low molecular weight protein marker；CK：Control（pET-PyMYBa ind

28、uced for 4 h by 0.8 mmol L-1 IPTG）. 6期 孙莎莎等：红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析 1189 pET-PyMYBa经IPTG诱导后，在22 30 kD处有一条明显的蛋白条带，与预测的PyMYBa蛋白分子量大小一致。重组蛋白的诱导量与诱导时间关系密切，在6 h表达量达到最大。 3 讨论 本研究中利用RACE-PCR技术从梨中分离了新基因，PyMYBa。结构分析表明，该基因含有两个明显的MYB结构域，为典型的R2R3-MYB转录因子。进化树分析表明，PyMYBa推导的氨基酸序列与PyMYB10、MdMYB1等植物花青苷调控MYB转录因子亲缘关系

29、最近，而与抑制花青苷合成的FaMYB1亲缘关系较远。NCBI blast结果表明，PyMYBa与PyMYB10等花青苷调控MYB转录因子同源性最高。因此推测PyMYBa可能具有与PyMYB10、MdMYB1等类似的功能，调控花青苷的合成。梨中可能存在包含PyMYB10、PyMYBa在内的多个花青苷调控MYB转录因子，这一现象与苹果、拟南芥等植物类似（Takos et al.，2006；Ban et al.，2007；Espley et al.，2007；Gonzalez et al.，2008；Dubos et al.，2010；Chagn et al.，2012）。 基因表达模式能够反映基因

30、特定的生物学功能。在梨中，PyMYB10基因在幼叶、花、果皮等富含花青苷的部位均有大量表达，调控以上部位花青苷的合成（Feng et al.，2010）。本研究中发现PyMYBa在幼叶、花、果皮等富含花青苷的部位表达量同样很高。在果实成熟期，PyMYBa与PyMYB10在果皮中的表达丰度类似。并且果皮中PyMYBa和PyMYB10对遮光和MeJA处理的响应趋势与花青苷含量变化趋势一致，意味着PyMYBa与PyMYB10一样在梨果皮、幼叶等器官花青苷合成中发挥重要的正向调控作用。梨花青苷调控MYB基因的表达模式与其它物种存在差异，有其自身的特点，如PyMYBa、PyMYB10在幼叶、花、果皮等器

31、官均大量表达，而矮牵牛花青苷调控MYB基因AN2、AN4及DPL分别在花瓣、花药、花冠脉络等部位特异表达（Albert et al.，2011）；果实成熟期，PyMYBa与PyMYB10在梨果皮中的表达丰度类似，而杨梅花青苷调控MYB基因MrMYB1在成熟果实中的表达量高，MrMYB2表达量极低（牛珊珊，2011），认为与不同物种的遗传基础有关。 MYB转录因子主要以蛋白的形式参与植物花青苷的调控，要深入了解它们在植物体内的生物学功能，必须从蛋白水平上进行研究。原核表达系统为研究MYB蛋白功能提供了一条有效途径。本研究中通过原核表达获得了PyMYBa重组蛋白，其大小与预测值一致。这一结果证实了

32、PyMYBa具有完整的读码框，其生物学功能有待于进一步明确。 References Albert N W，Lewis D H，Zhang H，Schwinn K E，Jameson P E，Davies K M. 2011. Members of an R2R3-MYB transcription factor family in Petunia are developmentally and environmentally regulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning. The Plant

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