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1、我国小豆种质资源遗传多样性RAPD分析 摘要：利用RAPD技术对我国小豆的8个野生种、34个地方种和6个已育成品种进行多态性研究。27个随机标记共扩增出247条DNA带,其中214条为特征带，占总数的86.6%,说明我国小豆遗传多样性丰富。当相似系数为0.35时，48份材料可被聚为六类，从聚类结果可以看出，同一地域或气候相似地区的材料较早聚为一类，说明供试材料遗传背景与其原产地背景相关，但有个别地区种质资源的亲缘关系仍需进一步研究。关键词：小豆 ； 种质资源 ； 遗传多样性 ； RAPD分析 Studies on the Genetic Diversity of Chinese Adzuki
2、Bean Germplasm Resources by RAPDWANG PENG(The Department of Plant Science and Technology,Beijing Agriculture College, Beijing 102206)Abstract: The genetic diversity of 8 wild, 6 cultivars and 34 local Chinese adzuki bean varieties was assessed by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).285 bands inc
3、luding 214 polymorphic bands were identified with 27 RAPD primers makers. The rate of polymorphisms was 86.6%, which indicted there is of abundance in genetic diversity of Chinese adzuki bean. The 48 cultivars were clustered in 6 groups as the coefficients was 0.35.The results of cluster combine sho
4、wed that the samples from the cluster based on molecular maker is similar to that based on morphological makers except for parts of germplasm from some area. Need further research.Key words: Adzuki；Germplasm Resources；Genetic Diversity；Analysis of RAPD小豆（Adzuki）别名赤小豆、红豆、朱豆，是我国北方主要杂粮之一。中国种植小豆的面积和产量均居
5、世界首位。小豆营养非常丰富，据测定，小豆籽粒中含蛋白质19%29%、脂肪0.4%2.7%、碳水化合物56%61%，每百克籽粒中含钙67mg、磷305 mg、硫胺素5.2 mg、核黄素0.11 mg、尼克酸2.7 mg。此外，还含有较多人体必需氨基酸及维生素等。小豆经济价值很高，因其适口性好，所以广泛应用于食品加工业。小豆也是重要的药膳原料，小豆籽粒性味甘酸，无毒，入心、小肠经，有利除湿，和血排脓，消肿解毒之功能，小豆的叶、花和豆芽也能入药治病。此外小豆的叶、秸秆还是营养丰富的优质饲料。不同小豆品种因其生物学特性不同，其应用范围和利用价值也不尽相同，如豆沙用小豆、配菜用小豆等。 因此,深入了解小
6、豆种质资源多样性及特异性对于开发小豆资源及小豆的综合利用尤显重要。目前我国小豆种质资源分类仅限于生态学上、细胞学上的分类及蛋白质水平上的分类：中科院品资所胡家蓬（1984）5将全国收集到的1040份材料分别根据粒色、熟性、粒重等性状特点进行了较详细的分类，并根据各地方品种的特性将我国几个主要生产区初步划分为四个小豆生态区：东北生态区、华北生态区、黄河中游生态区和云南生态区，而且对各区进行了描述。金文林（1985）6选择了与小豆有关的七个气候因子进行数值分析，初步将我国划分为八个小豆生态气候区，进而对各小豆类型进行了讨论。金文林等（1988）7通过对小豆染色体组型的研究，确定小豆染色体组型为:2
7、n=14M+6SM+2Sat。同时指出用于研究的4份材料染色体组型并无明显差异，从染色体角度分析小豆的遗传多样性还需进一步研究。金文林等（1997）8通过对十多种栽培小豆与野生小豆同工酶酶谱变异的研究，发现利用三叶期幼芽的淀粉酶、萌动的种子子叶和三叶期的顶小叶的酯酶同工酶酶谱可将野生种与栽培种、野生小豆与半野生小豆区分开。同时，研究还表明植物同工酶基因表达具有时空性，不同的组织来源以及不同生育年龄的同一类酶表现出极大差距，易受其它因素的影响。对以上传统方法而言，植物种内个体之间的遗传鉴定以及亲缘关系是综合考虑其形态学及农艺学特征或是通过生物化学分析方法检测来确定的，但这些方法容易受到环境的影响
8、，而且人们对其评估遗传亲缘关系的总体可靠性也存在一些争议( Gotllieb 19779；Brown197910)。因此目前人们普遍认为DNA水平上的多态性信息对于评判遗传多样性来说是最好的。此次我们选用RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA ）对小豆的种质资源多样性进行分析。RAPD技术是利用经PCR扩增出DNA片段通过电泳后，在琼脂糖凝胶上所表现的DNA片段多态性来反映碱基序列的多态性。RAPD分析时，一次分析只需一个引物，长度为10个核苷酸左右，引物的序列是随机的，因而可在被检对象无任何分子生物学资料的情况下，对其基因组进行分析。Yang和Quir
9、os(1993)1用RAPD标记对芹菜品种进行了鉴定及分类，通过28个引物检测到的变异就可将21个品种分成3个不同的组，结果与原来的分类相吻合。Hu和Quiros(1991)2也进行了相似的工作，他们只用4个随机十聚体引物就可以区分14个西兰花和12个花椰菜品种，同时发现不同种子公司的品种之间的差异比同一公司品种间的差异要大些，与预期的结果相同。此外，用这种方法还得到了其他一些植物种的特异表征图，包括咖啡(Orozco-Castillo等1994)、可可(Wilde等1992)、马铃薯(Demeke等1993)、燕麦(Dweikat等1993)、小麦(He等1993；Dweikat等1993；
10、Josh和Nguyen 1993)和苹果(Koller等1993；Mulcahy等1993)。邱丽娟等3以57个中国大豆祖先品系及育成品种和18个美国大豆品系为研究对象，结果表明，中国大豆种质与美国大豆种质不同，而且各国南北方种质也不同。这一结果为丰富中国大豆品种遗传基础的种质选择提供了理论依据。Makiko Mimura（2000）4研究发现栽培种及半野生种的变异较野生种的低，亚洲亚热带高原国家（如尼泊尔）野生小豆其变异程度较亚洲远东国家的大。同时东南亚及亚热带高地的栽培品种小豆显示出与远东区不同的RAPD的特点。他还假设栽培种小豆是由远东区野生种驯化而来的，野生小豆种间的遗传多样性来自于其
11、自身天然异化作用，而栽培种相对低的变异来源于驯化中人工异化作用。由此可见在进行家系分析、植物纯合系的鉴定、不同变种的同源分析，以及对种子污染的检测等方面，RAPD都具有重要的应用价值。金文林等（2004）曾对156个亚洲小豆材料进行过RAPD分析，所用的10条引物在各小豆种间均表现较高多态性，本课题在此基础上对我国小豆种质资源进行了更加详细的研究。1.材料与方法1.1 材料 国内48个小豆随机样本：地方种34个，野生种8个，已育成品种6个（见表1）。表1 供试材料Table 1 The experimental materials编号品种名称来源地生育类型编号品种名称来源地生育类型1JN002
12、北京育成25保303江苏栽培2B-1河北育成26保280安徽栽培3河北801河北育成27保276陕西栽培4JN1北京育成28保170河南栽培待添加的隐藏文字内容35JN2北京育成29保437四川栽培6JN5北京育成30保605山东栽培7保35北京栽培31保285安徽栽培8保144辽宁栽培32AZN/94C02贵州野生9保328黑龙江栽培33AZN/95C01贵州野生10保3吉林栽培34川1四川雅安严桥栽培11保11吉林栽培35川2四川雅安沙坪栽培12保98吉林栽培36川3四川荥经栽培13保24辽宁栽培37川4四川天全始阳栽培14保55辽宁栽培38川5四川阆中栽培15保79辽宁栽培39川6四川荣
13、县栽培16保45天津栽培40Azn/94c04贵州野生17保68天津栽培41Azn/97c01云南野生18保219山西栽培42Azn/96c01a云南野生19保243山西栽培43Azn/94c01贵州野生20保250山西栽培44Azn/94c04c贵州野生21保528山西栽培45Azn/96c01b云南野生22保204山东栽培46新疆1新疆昌吉栽培23保305山东栽培47新疆2新疆昌吉栽培24保203江苏栽培48川7四川阆中栽培1.2 DNA的提取与检测 将小豆种子播种在营养钵中，置于20恒温培养箱，培养至三叶期。取三叶期幼苗嫩叶，用冰块保温箱携至室内，将1-2g嫩叶放研钵中用液氮速冻，并快速
14、磨碎。用CTAB法提取DNA,并保存于100l TE中。使用前用灭菌蒸馏水将浓度调至10ng/l。1.3 RAPD-PCR扩增反应液组成: 蒸馏水15.1l，模板DNA 1l (10ng/l )，Mg2+ 2.5l (25mM)，dNTP 2.5l (2mM each)，10buffer 2.5l，引物 1.25l (10ng/l)，Taq酶 0.15l (5unit/l)，共25l。以上药品购自上海Sangon。使用PC-800型PCR仪进行RAPD-PCR扩增，反应条件设定为94预变性2min；94变性30s、37复性30s、72延伸90s，40次循环；72充分延伸5min；4保存。对扩增
15、产物进行电泳:在电泳槽内加入1倍TAE缓冲液，将2%琼脂糖凝胶浸没于缓冲液中， 将15l 扩增产物与1l溴酚兰溶液充分混合后注入点样孔中，每板胶上留一个点样孔加MARKER,通入100V电压。电泳结束后取出胶板，置于溴化乙锭中染色20min，紫外灯下照相。读数时以MARKER为参照，记录扩增后DNA片段位置，条带清晰可辩的记为1，缺失的记为0。1.4 数据分析试验数据用Jaccard遗传相似系数进行聚类分析，其公式：GSj=Na/（Na+Nb+Nc），其中Na为两材料共有带数目，Nb为i材料有而j材料缺失的条带数目，Nc为j材料有而i材料缺失的条带数目。使用SPSS11.0软件中的聚类分析功能
16、（Classify）进行计算分析，按照with-in group法聚类，并做出聚类图。2.结果与分析2.1 RAPD随机引物扩增结果采用上海Sangon公司生产的10碱基随机引物对6个材料（其中栽培种2个，半野生种2个，野生种2个）进行初步筛选，从48个随机引物中筛选出谱带清晰并呈现多态性的引物27个，对上述材料基因组DNA进行扩增。其中扩增谱带数较多的引物有S265、S266，扩增出14条带，具多态性的有13条，S37也扩增出14条带，具多态性的有11条，S147、S154扩增出13条带，具多态性的有12条，能较好地表现出这些材料基因组DNA上的差异。扩增谱带最少的S277只扩增出2条带，其
17、中1条具多态性。表 2 27条引物序列及扩增的总条带与多态性片段数Table 2 27 primer sequences ,total numbers and polymorphic bands of PCR amplified products序号引物引物序列扩增条带数特征带序号引物引物序列扩增条带数特征带1S35TTCCGAACCC111015S266AGGCCCGATG14132S36AGCCAGCGAA11916S277GTCCTGGGTT213S37GACCGCTTGT141117S313ACGGGAGCAA664S143CCAGATGCAC7418S321TCTGTGCCAC545
18、S146AAGACCCCTC9819S326GTGCCGTTCA856S147AGATGCAGCC131220S328GGGTGGGTAA997S152TTATCGCCCC6621S338AGGGTCTGTG1288S154TGCGGCTGAG131222S361CATTCGAGCC549S155ACGCACAACC9923S442ACGTAGCGTC5510S156GGTGACTGTG9624S452CAGTGCTGTG101011S157CTACTGCCGT9825S455TGGCGTCCTT8712S160AACGGTGACC111126S460ACACACGCTG10813S255AC
19、GGGCCAGT111027S511GTAGCCGTCT6514S265GGCGGATAAG1413total247214图1 S266 扩增照片Fig.1 The RAPD photograph by primer S26627个引物共扩增出247条DNA谱带，特异带214条，平均每个引物扩增9.15条谱带,特异带7.93条，多态性为86.6%。由于RAPD标记是一种显性标记，RAPD分析时一条带代表基因组一个位点的扩增产物， 此次扩增出的247条带相当于对这48个小豆种质基因组的247个基因位点进行了检测，其中214条扩增带具有多态性，说明小豆在这214个基因位点上存在着差异，86.6%的
20、多态性频率说明，我国小豆种质资源具有丰富的遗传多样性。2.2、聚类结果从图2中可以看出，当相似系数为0.35时，48份材料可被聚为六类，第一类包括15个种质（115号），是来自东北、北京、河北的栽培种和已育成品种；第二类包括16个种质（1624,2631号），为我国中北部、东部地区栽培种；第三类包括1个种质（25号）；第四类包括2个种质（3233号）；第五类包括2个种质（3436号）；第六类包括12个种质（3748号），来自我国西南、西北部地区。3讨论3.1 RAPD影响因素分析及解决办法 在做预备试验的时候我们发现，RAPD较易受到各种因素干扰，无论是引物、模板DNA、Taq酶的质量或浓度的
21、改变，还是退火温度的变化都可影响反应结果，导致电泳图谱中弥散背景、扩增产物消失及电泳谱带位置改变，使RAPD重复较性差，稳定性不加。为了尽量克服上述缺陷，要求我们在实验中做到：试验设计严密，试验设备调试精准，采用同厂家同批号试验药品，试验操作准确、规范。3.2 对总体的分析从聚类结果可以看出，此次参测的48个种质的遗传差异基本随着地域差异的加大而加大。同一地域或气候相似地区的材料较早聚为一类，说明供试材料遗传背景与其原产地背景相关。第一类：东北、华北大部分地区的栽培种与已育成品种的种间遗传差异较小，说明当地已育成品种是由这部分地区栽培种选育的。东北地区是天然的早熟种质库，华北的育成品种都有其早
22、熟背景；加之，近年我国小豆育种工作集中在这一地区，使得这一地区栽培品种相对单一。第二类：包括的我国中北部、东部的大部分地区，每个地区种质不多，但仍可表现出与其他地区的差异。第三类：为江苏海安绿小豆，与其他小豆品种外观差异明显。第四类、第五类、第六类：西南、西北部的种质多为地方栽培种与野生种，说明这些地区的栽培种是由当地野生种进化而成，可能这一地区受地理条件的限制，长期交通不便，人为选择、干扰较小，使较原始的遗传变异保留较多；而相对于其他地区而言，这三类中的种质资源间的遗传距离远，说明这些地区是我国小豆天然远缘基因库，这与以前的报道5,6是基本一致的。3.3 对个例的分析在图2中可以看到，两个天
23、津品种（16，17）与山西品种（18-21）的遗传距离是最小的，这是否表示天津的种质与山西的种质有着某种联系呢？笔者调查，天津属于一个移民城市，天津民间旧时曾流行着：问我祖先来何处，山西洪洞大槐树的说法。据天津市历史博物馆陈列的志书所载，天津许多早期人物籍贯是山西，文献中也有“自山西移民”的记载。试想现今天津的一部分人是从山西迁入的，则迁入的山西人就可能把山西的种质带往天津，这些种质在天津经过选择、培育，形成现在天津的地方品种。这仅仅是笔者的假设，是否正确还需要两地更多的种质资源来做进一步论证。由此想到，现在由于交通的日益发达，为引种工作提供了更加便利的条件，种质的流动范围较之过去范围更大，流
24、动速度更快，使种质资源的家系研究变得更加复杂。相同的种质在不同生态区域的表现型往往有所差别，使用传统家系分析方法对这些种质资源进行分析难免会产生误差或错误，这时利用分子生物学手段进行家系分析的好处就凸现出来了。相信随着分子生物学实验方法进一步的改进，实验准确度进一步的提高，利用分子生物学进行家系分析必将彻底取代传统分析方法。4 致谢本文是在金文林老师和郭蓓老师悉心指导下完成，他们那精熟的专业知识、严谨的学风、敏锐的分析能力给了我莫大帮助。感谢秦岭老师对此文英文摘要部分的指导。特别感谢文自翔师兄对我的帮助，我们从预备试验开始，同甘共苦，尝尽试验带给我们的烦恼和喜悦，在实验过程中一同摸索，不断提高
25、自己的实验水平和专业知识，为我们试验圆满完成打下了坚实的基础。恭喜他顺利考取南京农业大学博士学位。还要感谢一同做实验的王瑜、李志鹏同学及小豆组的老师、同学们，大家勤劳向上的精神无时无刻不在感染着我，我十分荣幸能成为这个集体的一员。最后，还有那二百多砵饱受摧残的小豆幼苗和超负荷运转的试验设备亦为我的实验贡献良多。参考文献1Clark Ms.植物分子生物学试验手册 1996：236-2582Hu J, Quiros CF. identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers, Plant cell rep,
26、1991 10:505-513邱丽娟， RandallL， Nelson，etaL.利用RAPD标记鉴定大豆种质J,作物学报， 1997 3 23（4）: 4084174Makiko Mimura, Kentaro Yasuda. RAPD variation in wild, weedy and cultivated adzuki beans in Asia, Genetic Resources and Crop Evolution 2000, 47: 603-6105胡家蓬.小豆资源研究初报，作物品种资源，1984 , 4: 9-126金文林.中国小豆生态气候区划，（油印本）北京农学院，19857郭淑华，金文林.小豆染色体组型分析，北京农业科学，1988，2: 19-228金文林，郝玉兰. 栽培小豆与野生小豆同工酶酶谱变异, 中国青年农业学术年报B卷 1997 18-229Gottlieb LD. Electrophoretic evidence and plant systematics, Ann Mo Gard 1977 64: 161-18010Brown AHD. Enzyme polymorphism in plant populations, Theor Appl Genet 1979 15: 1-42
