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1、赣 南 医 学 院2007届毕业生论文高速逆流色谱与微波辅助萃取分离纯化侧柏中的黄酮类化合物学校名称： 赣西医学院 学生姓名： 专 业： 药学 学 号： 班 级： 03药学本科班 完成日期： 高速逆流色谱与微波辅助萃取分离纯化侧柏中的黄酮类化合物摘要 首次采用高速逆流色谱仪TBE2300A与微波辅助萃取对侧柏药材中的活性黄酮类化合物进行分离纯化。实验过程中：微波辅助萃取，温度80，时间29min，功率800W;高速逆流色谱提取，对溶剂系统和参数条件进行系统的优化,获得较好的分离条件,溶剂系统:正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水(61112 ,V / V ) ,上相(有机相) 为固定相,下相(水相)
2、为流动相,反相洗脱；进样浓度:20mg/ mL ；进样体积:20mL ；流速:3.0mL/ min ；转速:850 r/ min 。进一步分离获得四种高纯度黄酮类化合物,经薄层色谱鉴定,分别为A类黄酮、B类黄酮、C类黄酮、D类黄酮，但其具体结构尚待确定。关键词 高速逆流色谱 微波萃取 侧柏叶黄酮类化合物1 引言侧柏叶为柏科(Cupressaceae) 植物侧柏Biota orientalis (L .) Endl . 的干燥嫩枝叶,侧柏别名扁柏、香柏、片柏、片松。常绿乔木,多为栽培,除青海、新疆外,全国均有分布且为我国特产。侧柏叶气清香,味苦涩、微辛。具有凉血止血、清肺止咳功效,在临床上常用于
3、治疗出血症、风湿痹痛、高血压、咳喘等。目前对侧柏叶的研究主要是关于其挥发油研究和总黄酮的研究，部分是关于其提取工艺的研究探索。其中对侧柏叶黄酮化合物研究有:炮制研究、质量标准研究、化学成分研究（挥发油、黄酮、鞣质、无机元素）、药理研究（止血作用、抗炎作用、抗肿瘤活性、）、临床研究。目前文献报道侧柏叶的主要成分是黄酮类化合物, 而且主要针对黄酮类化合物的含量测定,从其中提出的单体化合物只有对槲皮素和槲皮苷的报道。而黄酮类化合物成分甚多,不能只局限于槲皮素和槲皮苷, 故对侧柏叶中黄酮类成分的研究有待进一步深入。另外，对侧柏叶提取分离方法的主要文献报道有：微波辅助萃取法、超临界流体萃取(SFE)、索
4、氏提取法、热回流法、冷浸法、超声波法、水蒸汽蒸馏法、渗漉法、加压逆流提取法、旋流提取法、水提法、固相微萃取法、高压液相法、高速逆流色谱法、柱色谱法、重结晶法等。其中都是单独用到了微波辅助萃取法或高速逆流色谱法，未见关于两者联用提取分离侧柏叶黄酮化合物的报道。高速逆流色谱(high-speedc ounter-currentch romatography,HSCCC)是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程。无固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面产生化学反应而变不可逆吸附；分辨率高，可制备纯品；可采用正向或
5、反向的连续洗脱、步级洗脱、梯度洗脱等方式；可采用多种多样的溶剂系统实现物质的对流分配；能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分；仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱(highperformance liquid chromatography,HPLC),适用于制备高纯度、高附加值的化合物。近20年来HSCCC在生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物等众多领域成功应用。因HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件，因此在80年代后期，在
6、世界范围内的“回归大自然”浪潮的席卷下，HSCCC被大量用于天然产物化学成分的分析和制备分离。将 HS CC C用于天然产物分离，一方面可以在高类别天然药物新药的研发中，逐级分离制备活性部位或活性成分，配合活性跟踪与人药部位的设计；另一方面可以配合高类别中药新药申报工作，制备必需的高纯度指标成分和必需控制的杂质成分。本文探索了丹参脂溶性成分和雪莲黄酮的HSCCC分离条件。高速逆流色谱法分离的优点：首先,它不用固态支撑体,不存在样品组分的吸附、变性、失活、拖尾等现象,节省了材料和溶媒消耗；其次,它操作简便,重现性好,分离量较大,分离效率高,分离时间短,一般几个小时即可完成一次分离；此外,有广泛的
7、液一液分配体系可供选择,体系更换方便、快捷；它的进样量大,这对于样品的纯化制备显示出很大的优势。微波萃取( Micrwave Extraction, M ) 是产生在分析化学研究的基础上的， 是制备分析样品的有效方法之一。采用微波萃取法制备样品， 具有时间短、节省试剂、 制样精度高、 回收率高等优点。微波萃取技术是微波技术与萃取技术相结合产生的新技术。该技术最早研究开始于1986年， 匈牙利学者Can-zler k . 研究发展了用微波萃取法从土壤、 种子、食品、饲料中分离各类化合物的新技术。随着技术的不断完善， 微波萃取已用于农药残留、有机污染物、金属及其化合物、人血( 或血清) 、中药物、
8、植物有效成分的萃取分离过程中，其应用范围遍及环境分析、化工分析、食品分析、天然产物提纯、矿物处理、 生化分析、临床应用等领域。微波辅助萃取法的优点:设备简单操作简便，而且具有萃取时间短，成本低，萃取效率高,溶剂损耗较少,不产生噪音、适合于热不稳定成分且能在短时间内杀灭植物中的水解酶等优点。本项目的特色与创新之处在于首次将微波辅助萃取法和高速逆流色谱法联用提取分离侧柏叶黄酮类化合物，综合两方法的优点得到效率、纯度更高和种类更多的单体化合物；探索了一种更好的研究侧柏叶黄酮类化合物的方法。2 实验部分21 仪器与试剂仪器 TBE2300A 高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司) KTA prim
9、e 泵及紫外检测系统(美国GE 公司) HX21050 恒温器(北京博医康实验仪器有限公司) WF-4000 常压微波合成仪（山西太原优尼沃斯科技有限公司）DLSB-20L/20 低温冷确循环泵（巩义予华仪器厂） 试剂 侧柏粗提物制备及HSCCC 分离用溶剂(正庚烷、乙酸乙酯、甲醇等) 均为分析纯(成都科隆化学试剂厂) 实验用水经Milipore 超纯水制备系统净化。样品 侧柏叶采自赣南医学院内2.2 样品处理与制备材料 侧柏叶，清洗，晒干，粉碎，过目筛备用。将药材用80 %乙醇于微波辅助萃取30min，功率800W。在旋转蒸发仪中浓缩后水浴蒸干，得浸膏。加适量水入浸膏 ,混悬 ,依次用正庚烷
10、、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取。取乙酸乙酯萃取液蒸干 ,置于真空干燥箱 50 中完全干燥 ,得到棕褐色粉末（备用）。2.3 样品的初步鉴定：（1）盐酸一镁粉反应显色反应是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。将制备好的粉末溶解，吸取定容好溶液1mL于试管中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1-2min即可显色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红至紫红色，少数显紫至蓝色。该试验提取液（甲醇作溶剂）本色为灰黄色，其在该反应的试验中呈紫红色，而其在对照试验中呈橙色，证取液中含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合侧柏叶提取液中的黄酮类化合物主要为黄酮醇类。（2）紫外检测：取样品粉末溶
11、液稀释液，于紫外色谱仪下检测， 在紫外范围下有两个吸收峰，波长分别为366及273nm，与黄酮类化合物的紫外特征吸收光谱相符。2.4两相溶剂体系及样品溶液的制备本实验中HSCCC 溶剂系统为正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水(61112 ,V / V ) ,按比例将四种溶剂加入分液漏斗中,振荡使溶液充分混合,待静置平衡后分得上相(固定相) 和下相(流动相) ,分别超声脱气以备用。称取500 mg 侧柏药材粗提物,溶于25mL 下相(流动相) 中, 振荡使之完全溶解, 得20mg/ mL 样品溶液。2.5 溶剂体系选择：首先按选定的溶剂系统配制一定量的两相溶剂各取2 mL于小试管中，加入数毫克样品，剧
12、烈振荡1 min后静置分层，用毛细管取近似等量的上下两层溶液于TLC板上，待溶剂挥发完后用溶剂系统中的有机层或其它合适的溶剂系统展开，根据样品的性质，选用适当的显色剂显色，计算Rf值并观察斑点色度。比移值Rf=L/L0 （表1）表1 薄层色谱在正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水体系中的Rf情况正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水 Rf值 上相 下相8：1：1：10611127229711110.41 0.430.45 0.510.30 0.360.36 0.41 2.6HSCCC分离过程将正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水(61112 ,V / V ) 的上相(固定相) 连续泵入HSCCC 螺旋管,待螺旋管完全充
13、满固定相后,开启HSCCC 主机,缓慢调整螺旋管转速至850 r/ min ,顺时针旋转,同时以3.0 mL / min 的流速泵入流动相。当螺旋管尾端流出流动相,系统达到动力学平衡时,将样品通过进样阀注入螺旋管中。设置恒温水浴为25 。紫外检测器检测波长为254 nm ,根据色谱图手动收集各馏分。3 结果与讨论待添加的隐藏文字内容13.1 HSCCC 溶剂系统选择及实验参数的优化一个适宜的溶剂系统对于高速逆流色谱分离样品是非常关键的。在本实验中,共考察了正丁醇-乙酸乙酯-正己烷-水81110、61112 、7229 、71111 四个溶剂系统,通过薄层色谱实验发现, 正丁醇-乙酸乙酯-正己烷
14、-水=61112 系统有较好的固定相保留率,分离度以及峰形都较好,分离效果最优,因此选择作本实验的溶剂系统。此外,对影响分离效果的实验参数进行系统性优化:流动相流速、样品进样浓度。考察了四种流动相流速: 2mL/ min 、3mL/ min 、4mL/ min 、5mL/ min 。发现随着流速提高,固定相的保留体积有所减少,当流速为3mL/ min 时,获得最佳的分离效果,因此选用流速3mL/ min ；考察了3 种样品浓度:10mg/ mL 、20mg/ mL 、30mg/ mL 。样品浓度超过20mg/ mL时,样品浓液中出现了沉淀,样品浓度为10mg/ mL和20mg/ mL 时,都有
15、较好的分离度。在不影响分离效果的前提下,选择更大的样品浓度有利于处理更多量的样品,以达到制备分离的效果。因此选择浓度20mg/mL 。进样体积为20mL , 转速设定为850r/ min 。在最佳分离条件下, 固定相保留率为56 %。3.2 产物的结构鉴定根据HSCCC图谱,通过手动收集得到4个馏分(收集部位见图1) ,减压蒸干得到4种固体粉末。通过薄层色谱再次鉴定(见图2) 。 图1 图2分别为A类黄酮, B类黄酮, C类黄酮, D类黄酮3.4 结论与微波辅助萃取对侧柏药材中的活性黄酮类化合物进行分离纯化。实验过程中对溶剂系统和参数条件进行系统的优化,在最佳分离条件下,经过一步分离即获得A类
16、黄酮、B类黄酮、C类黄酮 ，D类黄酮。结构尚待确定。相比于传统的分离方法,高速逆流色谱进样量大,重现性好,加之其不需要任何固态载体,从而避免了不可逆吸附,使得样品具有较高的回收率,很适用于微量物质的分离制备。微波辅助萃取法设备简单操作简便，而且具有萃取时间短，成本低，萃取效率高,溶剂损耗较少,不产生噪音、适合于热不稳定成分且能在短时间内杀灭植物中的水解酶等优点。总之,高速逆流色谱与微波辅助萃取在天然产物的分离纯化领域具有独特的优势,前景良好,值得我们进一步的研究探索。参考文献1 曹雨诞，曾祥丽，单鸣秋.侧柏叶的研究进展J.江苏中医药杂志，2008, 40 (2):86-88.2 赵永光，常立新
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