利用小孢子培养创建大白菜结球甘蓝易位系.doc

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1、园 艺 学 报 2014，41（7）：13611368 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140114；修回日期：20140528 基金项目：国家自然科学基金项目（31171964，31101552）；十二五农村领域国家科技计划项目（2012AA100102-5）；农业科研杰出人才培养计划项目；河北省自然科学基金项目（C2010000677，C2014204093）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101302120006）；河北省高等学校科学技术研究项目（Z20

2、10149） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yywyh） 利用小孢子培养创建大白菜结球甘蓝易位系 胡永霞，李晓峰，轩淑欣，申书兴，王彦华* （河北农业大学园艺学院，河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室，河北保定 071001） 摘 要：为创建大白菜结球甘蓝易位系，以大白菜结球甘蓝3号单体异附加系（AA + C3）为试材，进行了游离小孢子培养，利用结球甘蓝C02连锁群相对于大白菜的特异InDel标记对获得的小孢子植株进行鉴定，从17个小孢子植株中筛选出1个具有结球甘蓝特异条带的植株。通过对InDel标记的加密设计，明确了该植株中外源甘蓝片段的大小为

3、1.03 Mb。利用大白菜A基因组10个连锁群上均匀分布的100个InDel标记对其进行分子鉴定，初步确定了该植株中甘蓝染色体片段位于大白菜5号染色体上。花粉母细胞减数分裂观察结果显示，该植株染色体数为20条，为添加结球甘蓝3号染色体片段的大白菜结球甘蓝易位系。 关键词：大白菜；结球甘蓝；小孢子培养；易位系；InDel标记 中图分类号：S 634.1；S635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1361-08 Obtaining of One Chinese CabbageCabbage Translocation Line by Microspore Cult

4、ure HU Yong-xia，LI Xiao-feng，XUAN Shu-xin，SHEN Shu-xing，and WANG Yan-hua* （College of Horticulture，Agriculture University of Hebei，Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China） Abstract：In order to create Chinese cabbagecabbage translocation

5、lines，isolated microspores of Chinese cabbagecabbage monosomic addition lines 3#（AA + C3）were cultured. Through identifying the obtained microspore plants by specific InDel markers located on Linkage group C02 of cabbage，one plant which has cabbage specific bands was identified from seventeen micros

6、pore plants. By designing multiple InDel markers around the targeted region，the exogenous cabbage fragment size is clarified as 1.03 Mb in this plant. Using one hundred InDel markers uniformly distributed on ten A genome linkage groups of Chinese cabbage，the chromosome fragment of cabbage was prelim

7、inary determined on the 5# chromosome of Chinese cabbage. Meiosis behavior of this translocation line showed that the chromosome number of this plant is twenty，which is identified as one translocation line introduced one segment of chromosome 3# in cabbage. Key words：Chinese cabbage；cabbage；microspo

8、re culture；translocation line；InDel markers 1362 园 艺 学 报 41卷 通过染色体易位将近缘种中的有益基因导入目标作物是作物改良最有效的途径之一（Li et al.，2013）。异源易位系具有携带非目的DNA片段少、遗传稳定、利用价值高的突出优点。自从Sears（1956）首次将小伞山羊草的抗叶锈病基因易位到小麦6B染色体上以来，仅小麦近缘植物的易位系就有60多个（Luan et al.，2010；Li et al.，2012；Wang & Chen，2012；An et al.，2013）。在蔬菜作物上，南京农业大学已创建了抗霜霉病（曹清河

9、等，2005）和枯萎病（钱春桃 等，2006）的黄瓜异源易位系；吴进义等（2013） 用60Co-射线辐照西瓜种子诱变培育了染色体易位系。 大白菜（Brassica compestris ssp. pekinensis，AA）育种一直存在着遗传基础单一的主要瓶颈，利用易位系导入携带有益基因的某条外源染色体或片段，成为改良品种的重要手段。结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata，CC）与大白菜同属十字花科芸薹属，具有抗逆性强、耐抽薹、耐旱等优良特性。研究表明，大白菜A 基因组与结球甘蓝C 基因组具有部分同源关系，为引进甘蓝有益基因提供了机会（Mason et al

10、.，2012）。 本实验室自2008年起开展大白菜结球甘蓝异附加系的选育与鉴定，先后获得整套大白菜结球甘蓝异附加系（吕文欣 等，2011）。本研究中以大白菜结球甘蓝3号单体异附加系为材料，进行游离小孢子培养，并对获得的小孢子植株进行细胞学、形态学及InDel标记鉴定，筛选出携带有甘蓝优良性状基因并且能够稳定遗传的纯合异源易位系，为加速大白菜的品种改良奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试材料为大白菜结球甘蓝3号单体异附加系（AA + C3）及其大白菜亲本85-1（AA，2n = 20）和结球甘蓝亲本11-1（CC，2n = 18）。以上材料由农业部蔬菜分子染色体工程与新品种选育团队提供

11、。 1.2 异附加系植株的小孢子培养 大白菜结球甘蓝3号单体异附加系组培苗于2012年1月移栽到温室，3月定植到田间，常规管理。在异附加系开花初期，挑选适宜大小的花蕾进行小孢子培养（申书兴 等，2006），每次取花蕾30个，在生物倒置显微镜下观察胚状体发生的过程，3周后统计出胚情况。胚状体发育到子叶期，将子叶胚接种于MS固体培养基上，在25 条件下进行植株再生。将获得的小孢子植株移接到1/2MS生根培养基上，于2013年1月将小孢子植株定植于温室。 1.3 小孢子植株的InDel标记鉴定 DNA提取采用改良的CTAB法，并用0.8%的琼脂糖对提取的DNA进行检测。 与结球甘蓝3号染色体对应的C

12、02连锁群特异InDel（insertion-deletion）标记序列由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供，大白菜A基因组10个连锁群的100个InDel标记来源于http：/brassicadb. org/brad/（高颖，2012）。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 采用本实验室筛选出的22个结球甘蓝C02连锁群特异的InDel标记（表1）对试验材料进行PCR扩增：94 变性3 min，94 变性45 s，60 退火30 s，72 延伸45 s，此后每个循环退火温度降低0.5 ，共计10个循环；94 变性45 s，55 退火30 s，72 延伸45 s，25个循环；72

13、延伸5 min，4 保存。 扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后利用银染的方法进行检测，照相。 7期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜结球甘蓝易位系 1363 表1 甘蓝C02连锁群特异InDel标记 Table 1 Specific InDel markers from C02 linkage groups of cabbage InDel标记 InDel marker 物理位置/bp Physical location 5引物序列 5 primer sequence 3引物序列 3 primer sequence C02-2 1 148 019 GACACTTGTTTCTTTCTCGC T

14、GTTTTAACCAGTGTTGCTG C02-3 2 127 233 ACAAGAAACCATTGGATCAG TGTGATTGGAACTCAGTCAA C02-4 3 944 891 TCTATCGGTTGGACCTAAAA GACTAGGCAGGAAGCACTAA C02-5 5 387 293 ACGCAATGTAGACAAGAACC TTGGATCCTCTTCTTGATTC C02-6 6 761 923 ATGAGCAAAATAGAAGGCAC CAAATCTCCCACACATTTCT C02-7 8 410 397 ATAAAAGGCCATACAGTCCA ATGTCTAGCCG

15、TGTTGTCTC C02-8 9 259 575 TGATACGCCTCAATACTGGT TGGAATTGCTAAAGTATGGG C02-9 10 672 209 GCACCACTAAAAACTTCCAC GATCCATCACTTGTCGATTT C02-10 12 440 349 CTCACACACACCAAACACAT GTCATACGGACCTAATCTGAA C02-12 14 909 364 TGCCGGTAGAGAATAAAGAA CAAAGATAGCACAAAAACCC C02-13 15 574 918 AGGGATGTTCCCATTCTACT AAGTTGTGTCTCT

16、TTTTGGC C02-14 18 096 496 GTAATTTAACCGGAAATGGC CTTCCATGCAGAACTCTGTT C02-15 18 786 494 ACCTAACGTTGTGGATTTGT TATTTCAGTTTCCCGACACA C02-16 19 965 249 ACATTCCATTTACCTGTTGC GTTTATGCTCGAAGTTGGTC C02-17 26 147 801 GTTCTGAACAAAACAGCTCA GTTCATCTTGCTGATAAGGC C02-18 32 286 015 TTTCTGGAAGTATTGTGCCT GGGTTGTCGACTA

17、TGTTTGT C02-19 34 568 194 TAAATTGTATACCCGAACCG TACTATTTCAAGTGCCCGTT C02-20 36 732 119 GCAACCACCTATTCACTGTT TGAAAGTGTTATACGGGAGG C02-22 38 349 354 AGCAACTCTTACATGACGCT ACCACACTGCTCAGGTAAAT C02-23 40 978 471 GATTTTGTGGTTAGCTTTGG AACACTGTTCAAAATGGGTC C02-24 42 101 407 CAACAACCACTAAATTCACC CCTAATAGAGATC

18、TTTTGCGTG C02-25 42 739 836 CCGGTTTATAAAACTCCACA AGATTCACATGGTACAAGGG 1.4 小孢子植株的细胞学鉴定 在小孢子植株开花初期，于911时采集大小适宜的花蕾，并将其用卡诺固定液固定48 h，转至70%的乙醇中，置于4 冰箱中保存。选取雄蕊长度是雌蕊的1/2 2/3的花蕾，剥取花药，用丙酸铁水合三氯乙醛苏木精染色，观察花粉母细胞减数分裂过程并显微照相（雷孟平 等，2013），从中获得染色体数为20的大白菜结球甘蓝异源易位系植株。 1.5 大白菜结球甘蓝易位系植株的田间性状观察 以二倍体大白菜和结球甘蓝亲本为对照，对大白菜结球甘蓝易

19、位系植株进行营养生长时期田间性状观察，主要包括株高、株展、球高、球粗、球形指数、株形、外叶形状、叶缘、叶色、叶面茸毛、叶球抱合情况和叶球形状等。 2 结果与分析 2.1 异附加系小孢子植株的获得 对大白菜结球甘蓝3号单体异附加系植株进行了游离小孢子培养，对小孢子植株再生过程进行观察，结果表明，培养约20 d后绝大多数小孢子胚发育成子叶形胚，但存在球形胚、心形胚、鱼雷形胚和畸形胚并存的不同步现象（图1，A）。成熟的子叶形胚接种到固体培养基上，一般能够再生出芽，进而成苗（图1，B），最后转接到1/2MS培养基促其生根成为完整的再生植株（图1，C）。共接种花蕾105个，出胚数为104个；共接种子叶形

20、胚70个，最终获得再生植株17株。 1364 园 艺 学 报 41卷 图3 结球甘蓝InDel标记C02-5-18（A）、C02-5-19（B）、C02-5-20（C）和C02-5-21（D）在小孢子植株的扩增 1：大白菜；2：结球甘蓝；3：11号小孢子植株。 Fig. 3 Amplification results of cabbage InDel markers C02-5-18（A），C02-5-19（B），C02-5-20（C）and C02-5-21（D） in the microspore derived plant 1：Chinese cabbage；2：Cabbage；3：Th

21、e No.11 microspore derived plant. 图2 结球甘蓝InDel标记C02-5在小孢子植株中的扩增 1：大白菜；2：结球甘蓝；3 19：小孢子植株。 Fig. 2 Amplification results of C02-5 InDel marker of cabbage in the microspore derived plant 1：Chinese cabbage；2：Cabbage； 319：The microspore derived plant. 图1 AA + C3异附加系小孢子植株再生过程 A：发育不同步的胚状体；B：成熟的胚状体转接生长；C：再生植

22、株。 Fig. 1 Plant regeneration with microspore culture in AA + C3 monosomic alien addition lines A：Microspore-derived embryos at different development stages；B：Regenerated shoots；C：Regenarated plant. 2.2 小孢子植株的分子鉴定 利用结球甘蓝02连锁群的22个特异InDel标记（表1）分别对二倍体大白菜亲本85-1，结球甘蓝亲本11-1，以及获得的小孢子再生植株进行PCR扩增。结果表明，仅有InDel

23、标记C02-5在11号小孢子植株中扩增出与甘蓝亲本一致的片段（图2），而其它标记在小孢子植株中扩增结果均与大白菜亲本相同，表明11号小孢子植株插入了甘蓝C02连锁群5 387 293 bp位置的片段。针对C02连锁群5 387 293 bp位置进行了上下游标记的加密设计，然后利用5 387 293 bp上下游的28个InDel标记（表2）对其进行进一步鉴定，结果表明，标记C02-5-18、C02-5-19、C02-5-20和C02-5-21在11号小孢子植株能扩增出特异条带（图3），其它标记没扩增出特异条带，从而确定插入的甘蓝片段的位置为5 280 822 bp与6 314 397 bp之间，

24、大小约为1.03 Mb。 为了探明甘蓝染色体片段插入大白菜染色体的具体位置，利用均匀分布于大白菜A01 A10连锁群的100个InDel标记对该植株进行了分子鉴定。结果表明，100个InDel标记中99个标记在11号小孢子植株中的扩增结果均与大白菜亲本相同，只有标记A05-1（片段物理位置为57 480 bp）在该植株中仅扩增出与甘蓝亲本一致的条带，未扩增出大白菜亲本的片段（图4），表明11号小孢子植株在大白菜A05连锁群（即5号染色体）的57 480 bp位置插入了甘蓝片段。 7期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜结球甘蓝易位系 1365 表2 甘蓝C02连锁群特异InDel标记 Tabl

25、e 2 Specific InDel primer pairs from C02 linkage groups of cabbage InDel标记 InDel markers 物理位置/bp Physical location 5引物序列 5 primer sequence 3引物序列 3 primer sequence C02-5-1 4 848 973 ATGAATCTAGCCAGAAAGCA AGTACTGGAGCAAGAATCCA C02-5-2 4 877 318 CTATCACTCATCATGCCAAA TGACACACAAGCCACTAAAA C02-5-3 4 881 492

26、 TCCATTAACGAGTGTTTAGG TACAAAAACAGTTTGCCCAC C02-5-4 4 898 593 GAGACAGTGCATGCGTAATA TGTACCCAACAACCTCATAA C02-5-5 4 898 625 AATCTCGATATCCGATTGTG AACATAGCATAAGAGGCACG C02-5-6 4 909 813 ACACTCAAGTTAATGGGTTG TGTTAGTTATGAATTCCCCG C02-5-7 4 984 793 CCAGGGTATTTCCAAGGC GGTTCAGGTGGCAAGTAGT C02-5-8 4 985 209 GG

27、GGGTTTTCTTAATGGTT ATGAACACTAGGCTCTCGTT C02-5-9 4 985 338 TGCAAGTTTTGTCTAGGTTC CTACCAAACTTGTTCTTCGC C02-5-10 4 992 675 TGTACGTACGTGCGTGTAT ACGCTCTTTCTGTTTCTGTC C02-5-11 5 095 313 CTCGTAAATCTCGCAATTCT TTGCCTTCCACTACACCTTA C02-5-12 5 112 994 GCCTTGTATTGACCAATTTC CCGTTAATGGGTAATGTGAA C02-5-13 5 114 208

28、TTTAACTCGCTCGTACCTTC TGTTCTGTAGTCGTTGATGC C02-5-14 5 128 331 AAGAAGAAGGACGTTGAACA CTCTAATGCAAAAGACACCC C02-5-15 5 130 369 TTGTCGTCAGCAATAACAAG CATGCCTTGGAGTTACATAAG C02-5-16 5 131 088 CATTGCCAAGAAAATGCAC TTTGGATTCCTTTAGCAGAG C02-5-17 5 142 055 ACGTTAAAATGGGACTGATG TGTGGCTTTGACTATGAATG C02-5-18 5 280

29、 822 ACGTTTCCTGAACCTAATAGAC GTGGGAATGAGATGAGATTG C02-5-19 5 383 113 ACATACAGAAAATGGTGGCT GAGTACTGCCAGAAGAGGAG C02-5-20 6 266 734 TCAACCACTTATCGTCACAA AAGACTCCTTCCTCTCTTGG C02-5-21 6 314 397 GCACACTGCTTTTTCTCTCT GCAGAGAATCAGAGTCCAAG C02-5-22 6 346 462 TGGTGATCCTCTTTGATACC CCTGAAGAGGTAACTTCTGGT C02-5-

30、23 6 351 001 GTTCGAGCTGATATTGATGA CCAGAAGCCAAGAAGAAAC C02-5-24 6 408 615 CGATGGTTGATGATTCTCTT GAGAAGGAAAGTCACACGAG C02-5-25 6 481 348 CGGAGCATAATTTTCCTGT TAACAAACAAGTACCACCCC C02-5-26 6 482 871 CCCAACATCTCTTTTTGTTC GTTTGTCTGAATCCACCAAT C02-5-27 6 493 866 GTTGTAATATGTGGGTGGGA AAGATTCATCTACCCAAGCA C02

31、-5-28 6 515 878 TTCTGAGGAAGTGGAGGTC CACTGTCAGAACCTTCATCA 图4 大白菜InDel标记在小孢子植株中的扩增 1：大白菜；2：结球甘蓝；3：11号小孢子植株。 Fig. 4 Amplification results of Chinese cabbage InDel markers in the microspore derived plant 1：Chinese cabbage；2：Cabbage；3：The No.11 microspore derived plant. 2.3 小孢子植株的细胞学鉴定 对具有结球甘蓝条带的11号小孢子植株

32、进行花粉母细胞减数分裂观察，在减数分裂终变期，花粉母细胞以10个二价体（10II）的联会形式存在（图5，A）；中期大部分细胞的染色体排列于赤道板（图5，B）；后期染色体以10-10的分离方式分离（图5，C）；后期染色体以10-10-10-10形式的分离（图5，D）。说明该植株染色体数为2n = 20，为大白菜结球甘蓝整倍体异源易位系。 1366 园 艺 学 报 41卷 图5 小孢子植株的减数分裂观察 A：终变期；B：中期；C：后期；D：后期。 Fig. 5 Miosis of the microspore plant A：Diakinesis；B：Metaphase；C：Anaphase；D：

33、Anaphase. 2.4 易位植株的田间性状观察 田间性状调查结果表明，该易位植株营养生长期表现出外叶近圆形、叶缘钝锯、叶面有少量的刺和茸毛（图6，A）等与二倍体大白菜亲本85-1（图6，B）相似的性状，叶色表现为与结球甘蓝亲本11-1（图6，C、F）相似的灰绿色。此外，还表现出株形平展、开展度变小、叶面稍皱、叶球舒心、叶球直径变小（图6，D）等不同于大白菜亲本85-1（图6，E）的独特性状。 图6 易位植株的田间性状 A、D：易位植株；B、E：大白菜；C、F：结球甘蓝。 Fig. 6 Field characters of translocation lines A，D：The trans

34、location plants；B，E：Chinese cabbage；C，F：Cabbage. 3 讨论 自20世纪50年代以来，在小麦上广泛开展了异源易位系创制方法的研究，先后建立了利用远缘杂交、辐射诱变、Ph基因突变体、组织培养和杀配子染色体等诱导易位系的程序（陈升位 等，2008）。为了解决传统创制易位系方法育种周期较长、效率不高的难题，石丁溧等（2008）提出了一种以单体异附加系为起始材料创制易位系的方法，该方法可利用异源单价体遗传不稳定性和在减数分裂中出现高频断裂和重融等现象，使破碎的外源染色体小片段随机整合到受体染色体上的不同位置，形成各种小片段易位系。李瑞芬等（2006）采用单

35、体异附加系花药培养方法创制了小麦中间偃麦草纯合易位系。与花药培养相比，游离小孢子培养具有不受母体组织影响，一次培养产胚量大等优点，能够显著提高纯合易位系的获得率。但到目前为止，利用单体异附加系小孢子培养技术7期 胡永霞等：利用小孢子培养创建大白菜结球甘蓝易位系 1367 创建易位系新种质的研究国内外鲜有报道。 目前，麦类作物易位系中外源染色体片段的鉴定方法主要采用基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）（Song et al.，2013）。已有研究表明，芸薹属中A、C染色体组间亲缘关系较近，采用常规的GISH很难区分，而以rDNA为探针的荧光原位杂

36、交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）只能区分A和C基因组的部分染色体（孔芳 等，2008）。尽管Howell等（2008）在甘蓝型油菜中利用45S rDNA及甘蓝染色体特异的BAC作为探针连续进行了FISH和GISH两次重复杂交，但仍有两条C基因组的染色体无法区分。SSR标记作为一种共显性的标记，不仅多态性高，稳定性好，且操作简单，广泛应用于麦类作物易位系的鉴定中（Cseh et al.，2011；徐皖彬 等，2012；Kruppa et al.，2013）。目前本实验室已建立了结球甘蓝相对于大白菜的连锁群特异SSR标记，并成功用于大白菜结球甘蓝

37、异附加系中外源染色体的鉴定（顾爱侠 等，2009）。但由于获得的结球甘蓝每个连锁群特异性SSR标记较少，无法精确鉴定大白菜结球甘蓝易位系中外源染色体片段。随着芸薹属植物基因组学的发展，各种新型的分子标记被开发应用，如基于基因组测序的InDel（insertion- deletion）标记，具有数量多，扩增产物稳定和易于检测等优点，基本可以满足精细定位外源染色体片段的需要。本研究利用实验室筛选出的结球甘蓝C02连锁群特异InDel标记，对大白菜结球甘蓝3号单体异附加系小孢子植株进行鉴定，从中筛选出1个添加结球甘蓝3号染色体片段的大白菜结球甘蓝纯合易位系，利用加密设计的甘蓝C02连锁群特异InDe

38、l标记明确了外源甘蓝片段的大小为1.03 Mb。为了探明甘蓝染色体片段插入大白菜染色体的具体位置，利用大白菜A基因组10个连锁群上均匀分布的100个InDel标记进行分子鉴定，初步确定了甘蓝染色体片段位于大白菜5号染色体上。 本研究中首次采用单体异附加系小孢子培养技术创建易位系新种质，并利用InDel标记对易位系中外源染色体片段的大小及位置进行分子鉴定，建立了大白菜结球甘蓝异源易位系的高效诱导及鉴定方法。目前，对于该易位系中外源甘蓝片段对大白菜基因表达的影响正在做进一步的研究。 References An Diao-guo，Zheng Qi，Zhou Yi-lin，Ma Peng-tao，L

39、Zhen-ling，Li Li-hui，Li Bin，Luo Qiao-ling，Xu Hong-xing，Xu Yun-feng. 2013. Molecular cytogenetic characterization of a new wheat-rye 4R chromosome translocation line resistant to powdery mildew. Chromosome Research，21 (4)：419432. Cao Qing-he，Chen Jin-feng，Qian Chun-tao. 2005. Identification and charac

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