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1、牛奶中部分成分的分析一、实验目的（1）学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白（2）掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法（3）熟悉可见光分光光度计的操作（4）加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼（5）分析牛奶中蛋白质与钙的含量。（6）掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法（7）通过与牛奶包装上注明的含量比较，对实验分析结果进行客观评价二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，加入醋酸将牛乳的pH调至4.7时，使酪蛋白沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，抽滤、纯化后便可得到纯酪蛋白。
2、双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，
3、孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH1213，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。三、材料、试剂与仪器（一）材料 新鲜牛奶、加钙牛奶（二）试剂95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuS045H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、
4、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、铬蓝黑R、盐酸羟胺、邻二氮菲（邻菲啰啉）、浓硝酸、硫代硫酸钠、甲基红、氨水1.、0.2 molL-1 pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。 取醋酸钠固体1.64g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸1.37mL加水稀释至120ml，取A液94.79mL，B液105.21mL, 混合即得pH4.7的醋酸醋酸钠缓冲液200mL。2、乙醇乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）3、NaOH（6molL-1）：称取12g氢氧化钠溶于50mL水中。4、双缩脲试剂：称取CuS045H
5、2O 3.0g，酒石酸钾9.0 g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加6 molL-1NaOH l00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。5、0.9NaCl6、蛋白质标准液(10mgmL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。7、待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）8、EDTA(0.01mol
6、L-1)：称取2.0g EDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于聚乙烯塑料瓶中。9、CaCO3标准溶液(0.01 mol L-1)：准确称取基准物质CaCO30.1g左右，先以少量水润湿，再逐滴小心加入6 molL-1HCl，至CaCO3完全溶解，定量转入100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。 10、NaOH（5 molL-1） 11、HCl（6 molL-1） 12、三乙醇胺(200gL-1) 13、铬蓝黑R(5 gL-1)乙醇溶液（三）仪器试管、移液管（1mL、5mL、20 mL）、 l0mL容量瓶、烧杯、表面皿、250mL锥形瓶、1000mL棕色试剂瓶、25m
7、L具塞比色管、试管架、坩埚、60mL分液漏斗水浴箱、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、精密pH试纸（可测pH4.7），酸度计、电炉、温度计四、操作步骤（一）牛奶中酪蛋白的提取1、酪蛋白的粗提50mL鲜牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲液50mL用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r min-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的纯化用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000rmin-1），弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗
8、沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。3、准确称重，计算含量和得率含量：酪蛋白g/(100 mL)牛乳（二）酪蛋白含量的测定1、标准曲线的绘制与样品的测定 取试管8支，按下表操作。123456测定管1测定管2蛋白质标准液(mL)0.200.400.600.801.00待测蛋白样品(mL)1.001.000.9%NaCl(mL)1.000.80.600.400.20-双缩脲试剂(mL)4.004.004.004.004.004.004.004.00吸光度A各管混匀、放置37水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。2、计算 在电脑上以吸光度值为纵
9、坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(gL)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。（三）钙含量的测定1、EDTA溶液浓度的标定 准确移取20.00mL CaCO3标准溶液3份分别于250mL锥形瓶中，加入2mL NaOH溶液，铬蓝黑R指示剂34滴，用EDTA溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去EDTA毫升数和CaCO3标准溶液的浓度，计算EDTA溶液的浓度。2、钙制剂钙含量的测定 准确移取一定量的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇
10、胺溶液5mL，5molL-1NaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R34滴，用0.01molL-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加23滴铬蓝黑R，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。 3、注意事项 量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 molL-1EDTA体积为2030 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加23滴指示剂。 思考题1、了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系3、本实验中哪些物质质量需要准确称量，哪些溶液体积需要准确量取？4、除本实验选用的方法外，测定蛋白质与钙还有那些方法？
