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1、编号 学士学位论文罗勒中黄酮的提取及抑菌作用的初探中文摘要采用超声波辅助法提取罗勒中的总黄酮，探寻提取溶剂、溶剂浓度、提取时间、料液比等因素提取罗勒中总黄酮的最佳点。再采用滤纸片法测定样品提取液对供试菌的抑菌效果。结果表明：提取罗勒茎中的总黄酮以70%乙醇浓度为最佳溶剂，1:40料液比下超声提取10min效果最优，提取率为62.5%；提取罗勒叶中的总黄酮以50%乙醇浓度为最佳溶剂，1:20料液比下超声提取20min效果最优，提取率为81.9%。提取液对巨大芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌有一定的抑制作用，对枯草芽孢杆菌无明显抑制作用。罗勒中的黄酮对细菌有一定的抑制作用，是一
2、种天然的抑菌剂，可用于医药研究发展。关键字：罗勒，黄酮，超声波提取法，提取工艺，抑菌作用AbstractUltrasonic assisted method is used to extract flavonoids in basil, extraction solvent, solvent concentration, extracting time, and solid-liquid ratio factors such as the best point extraction of flavonoids in basil.To filter method is used to deter
3、mine the sample extract of antimicrobial antibacterial effect.The results show that the extracted flavonoids in basil stem with 70% ethanol concentration as the best solvent, 1:40 material liquid than the optimum ultrasonic extraction under 10 min effect, extraction rate is 62.5%;Extraction of flavo
4、noids in the basil leaves to 50% as the best solvent, ethanol concentration and slurry optimal results than the ultrasonic extraction for 20 min, extraction yield of 81.9%.The experiment of basil flavonoid extract of Bacillus megaterium and Staphylococcus aureus have strong inhibition, for Escherich
5、ia coli has certain inhibition, the Bacillus subtilis without inhibition.Flavonoids of bacteria of basil has certain inhibitory effect, is a natural antibacterial agent, can be used in the pharmaceutical research and development.Key words: basil, flavone, ultrasonic extraction, extraction technology
6、, bacteriostatic action目 录中文摘要IAbstractII前言11.材料与方法21.1 实验材料21.2 试剂与药品21.3 主要仪器21.4 实验方法21.4.1 芦丁标准曲线的绘制21.4.2 重复性与稳定性试验31.4.3 定性测定31.4.4 黄酮的提取工艺研究41.4.5 总黄酮的抑菌作用研究42.结果与分析52.1 重复性与稳定性52.2 定性测定52.3 提取工艺的研究52.3.1 不同提取溶剂对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响52.3.2 不同乙醇浓度对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响62.3.3 不同提取时间对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响62.3.4 不同料液
7、比对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响72.3.5 正交试验设计72.4 总黄酮的抑菌实验103.结论11附录12致谢14前言 罗勒（Ocimum basilicum L.），为唇形科罗勒属植物。原产非洲、美洲及亚洲热带地区。中国只要分布于新疆，贵州，云南、四川等地。罗勒中的化学成分主要为挥发油、黄酮类、生物碱类、脂肪酸类等1。黄酮类化合物几乎遍布植物体的各组织和器官，常以游离态或苷的形式存在，是植物界最为广泛的一类次级代谢产物2-3。在初花期将植物除木质茎外部分剪下，可提炼芳香油、丹宁以及其他附属药物。 罗勒是常用的香辛调料，多见于西式食谱及泰国菜，作为药食兼用植物，罗勒具有广泛的药理作用，包括抗
8、菌作用、抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂、抗突变、抗寄生虫等4。可疏风行气，发热解表，散瘀止痛5。用于风寒感冒，胃腹胀满，消化不良，月经不调，跌打损伤等症的治疗；外用于虫蛇咬伤、湿疹、皮肤病等。罗勒的叶、种子、果实在维吾尔民间有着广泛的应用：临床用于治疗心虚、房颤、动脉硬化、高血压、高血脂、头痛、咳嗽、腹泻等6。作为传统的民间草药，一般将叶片捣烂后用开水浸泡，饭后饮用可起到促进饮食，帮助消化的作用。在现代工业中，罗勒更多的用作调香原料，配制化妆品，皂用及食用香精，也可以用于制牙膏、漱口剂中作矫味剂。罗勒在新疆各地栽培，其中库车的罗勒较为著名。新疆人已经对罗勒有很长的使用历史，不仅用作香料，洗澡，
9、随葬品，而且用于做食品调味剂，比如：泡茶，做混沌、馒头，嫩茎叶可调制凉菜，油炸或做汤。有报道指出，厨房放一丛罗勒盆栽可减少苍蝇7。 本研究以芦丁为标准品，优选超声波辅助法提取罗勒中的总黄酮8-9，用可见光分光光度法测量其含量。通过实验初步探寻提取溶液、溶液浓度、提取时间、料液比等单因素提取罗勒中总黄酮的最佳点，进一步利用正交试验验证、确定各单因素的最适实验条件，优选提取参数，确定罗勒中总黄酮量超声提取的最佳工艺10-13。用此参数实验得到样品提取液，再采用滤纸片法测定样品提取液对对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的抑菌效果，验证罗勒提取液对以上菌体是否有抑菌作用14-15。
10、1. 材料与方法1.1 实验材料材料：罗勒,2013年秋采于喀什农校，材料洗净，阴干，茎叶分开，于干燥箱中60干燥4h，粉碎后过60目筛，分别置于广口瓶中待用。菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 （所用各种细菌为本学院微生物实验室提供）1.2 试剂与药品芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、甲醇、无水乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚、三氯化铁、结晶氯化铝、醋酸钠、盐酸、镁粉、锌粒。（所有试剂均为分析纯，由本系药品库房提
11、供）1.3 主要仪器高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）、远红外辐射干燥箱 766-O型（上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）、电子天平 FA2104N（上海民桥精密科学仪器有限公司）、双频数控超声波清洗器 KQ-200VDB型（昆山市超声仪器有限公司）、可见光分光光度计 S22PC（Leng guang Tech,MADE IN CHINA）、旋转蒸发器 RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）、真空泵、BCM-1000型生物净化工作台（苏州净化设备有限公司）、恒温培养箱。1.4 实验方法1.4.1 芦丁标准曲线的绘制精密称取芦丁对照品10.00mg，用60%微热乙醇定容至100mL，摇匀，
12、制成0.1mg/mL的对照品原液。分别准确量取该芦丁原液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于10mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.50mL,摇匀，静置6min；再加10%硝酸铝溶液0.50mL，摇匀，静置6min；再加4%氢氧化钠溶液4.00mL,用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10-15min。用分光光度计在510nm处测定吸光值，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。通过回归分析得其标准曲线方程为y=14.210x+0.1531，相关系数r=0.9844。如图1。结果表明，芦丁溶液在一定范围内具有良好的线性关系。图1 芦丁溶液
13、的标准曲线1.4.2 重复性与稳定性试验称取0.500g样品，50%乙醇溶液浸提，40，45kHz超声处理20min。重复5次试验，取5次重复的平均值验证其重复性试验；测定同一提取液2h内的吸光值，每隔适宜时间段测定一次，记录吸光值，验证其稳定性。1.4.3 定性测定1.还原试验 盐酸-镁粉（或锌粉）反应：是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物显橙红至紫红色。 盐酸-镁粉反应：取1mL样品溶液于试管中，加适量镁粉振荡，再加几滴浓盐酸，观察其泡沫颜色。 盐酸-锌粒反应：取1mL样品溶液于试管中，加适量锌粒振荡，再加几滴浓盐酸，观察其泡沫颜色。金属盐类试
14、剂的络合反应 （1）铝盐：常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的络合物多为黄色，并有荧光，可用于定性及定量分析。紫外灯下观察，黄色、绿色、橙色均为黄酮类；天蓝色或者黄绿色为二氢黄酮。 三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化。 （2）三氯化铁：水溶液或醇溶液为常用的酚类显色剂。多数黄酮类化合物因分子中含有游离酚羟基，与三氯化铁水溶液或醇溶液可产生阳性反应，呈现颜色；当含有氢键缔合的酚羟基时，颜色更明显。有酚羟基的黄酮遇三氯化铁显蓝绿棕红褐色等反应。 三氯化铁反应：取几滴样品溶液于白瓷板上，滴加1%三氯化铁乙醇溶液，观察颜色变化。3.碱性试剂显色反应
15、在日光及紫外光下，通过纸斑反应，观察样品用碱性试剂处理后的颜色变化情况，对于鉴别黄酮类化合物有一定意义。二氢黄酮类可转变为查耳酮类化合物，显橙黄色。黄酮类化合物与碱性试剂显黄、橙、红色。黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色。 碱性试剂显色反应：在样品液中加入5%NaNO2溶液，摇匀，静置6min,再加入等体积10%Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min后再加入4%NaOH溶液，摇匀，观察其颜色。1.4.4 黄酮的提取工艺研究根据总黄酮提取工艺流程，试验分别设计不同提取溶剂、不同浓度、不同提取时间、不同料液比4个因素，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定黄酮浓度，从芦丁标准曲线方程中查出总黄
16、酮含量，计算出总黄酮的提取率16-17，比较其提取效果。选定溶剂后，再将每因素设3个水平，设计正交试验确定影响提取率的主次顺序。每分样品均重复3次，取平均值。提取工艺流程：样品称量溶剂浸润超声处理离心提取液含量测定浓缩至膏状单因素试验设计：溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚浓度：50%、60%、70%、80%、90%、100%时间：10min、20min、30min、40min料液比：1:10、1:20、1:30、1:40总黄酮提取率计算公式： 提取率(% )=（C 25V1）/（m V21000）100% 式中：C 为黄酮浓度(g/m l)；V 1 为实验溶液的体积(ml)；V 2 为显
17、色所移取的实验溶液体积(ml)；m 为罗勒质量181.4.5 总黄酮的抑菌作用研究在超净工作台上将各种待试菌悬液各吸取0.2mL均匀地涂布于平板表面，制成含菌平板。将已涂布好的平板皿底划分成4等分，每一等份内表明试验材料液的代码。用无菌镊子夹取直径6mm无菌滤纸片，置于空白对照（无菌水）、阳性对照（青霉素钠液）、阴性对照（0.9%无菌生理盐水）和不同浓度黄酮待试液中浸泡20min，然后取出轻贴于平皿的对应代码处。细菌于37培养24h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径，比较抑菌作用的大小。每菌种做3次重复，注意取出滤纸片时保证滤纸片所含材料液量基本一致，并在壁上沥去多余溶液19。2. 结果与分析
18、2.1 重复性与稳定性表1 重复性实验结果取样数12345RSD（%）吸光值0.5470.5650.5390.5430.5622.54重复性试验中，提取液的吸光值基本保持不变。相对标准偏差(RSD)为2.54%,说明该方法测定罗勒中黄酮含量的重现性良好。表2 稳定性实验结果时间/min0102030406090120RSD（%）吸光值0.5620.5620.5610.5640.6520.6510.5580.5560.36 稳定性试验结果表明，样品溶液在显色后 20min40min内吸光度变化不明显,此后随时间延长,吸光值略显下降。相对标准偏差(RSD)为0.36%。因此样品测定应在显色后 20
19、min40min内完成,稳定性较好。 2.2 定性测定表3 显色反应实验结果三氯化铝三氯化铁盐酸-镁粉盐酸-锌粒碱性试剂颜色现象黄色墨绿色浅红色浅紫色浅粉色 本试验结果表示该提取溶液中含有黄酮类化合物。2.3 提取工艺的研究2.3.1 不同提取溶剂对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响图2 不同溶剂对黄酮提取效果的影响 黄酮类化合物为亲水性物质，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。采用5种有机溶剂进行总黄酮的提取，由图2可以看出，对于罗勒的茎与叶的提取中，甲醇、乙醇、丙酮的提取效果良好，且相差不大，甲醇的提取效果最优。但是，考虑到甲醇与丙酮含有有毒成分，且成本较高，生产中一般不予采用，故选择使用乙醇为最佳提取
20、溶剂。2.3.2 不同乙醇浓度对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响图3 不同浓度对黄酮提取效果的影响 试验采用乙醇为提取溶剂20，由图3可以看出，乙醇浓度的不同也会影响提取效果。对于罗勒茎的提取中，50%乙醇提取效果最优；对于罗勒叶的提取中，浓度较高提取的效果较好，在50%处，浓度低但其提取效果也良好，且与高浓度乙醇提取效果相差不大，综合考虑，选50%乙醇浓度为最佳浓度。主要考虑耗材量等因素，选取50%、60%、70%3个浓度作为正交因素。2.3.3 不同提取时间对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响图4 不同时间对黄酮提取效果的影响 由图4可以看出，提取时间的长短也会影响黄酮的提取效果。对于罗勒茎的提取中
21、，在10至40min内提取效果虽有提高但幅度较低不明显；对于罗勒叶的提取中，20min效果最好，时间过长提取效果反而降低。综合考虑，选20min为最佳提取时间。故从效率出发，选取10、20、30min作为正交因素。2.3.4 不同料液比对罗勒叶与茎黄酮提取效果的影响图5 不同料液比对黄酮提取效果的影响 以样品质量与溶剂体积的比值为料液比，由图5可以看出，不同料液比对黄酮的提取效果不同，对于罗勒茎与叶的提取中，1:20料液比的提取效果最优。故选取1:20为最佳料液比。从节省成本，提高效率考虑，选取1：20、1：30、1：40三个料液比因素进行正交。2.3.5 正交试验设计 用正交试验方案综合考察
22、提取溶剂浓度、时间、料液比3个因素对黄酮提取的影响，每个因素选择3个水平（如表4）。以黄酮类化合物提取的浓度为考核指标，用L9（33）正交表进行试验，结果如表5-8。表4 正交因子水平水平因素A浓度/%B时间/minC料液比150101:20260201:30370301:40表5 正交试验因素及水平设计（茎）编号A（%）B（min）C黄酮浓度（mg/mL）11110.32821220.27931330.26942120.26852230.25662310.33673130.69083210.30893320.261均值K10.8761.2860.972均值K20.8600.8430.808均
23、值K31.2590.8661.215极差R0.3990.4430.407最佳工艺A3B1C3表6 方差分析（茎）因素偏差平方和自由度F显著性A0.251250.200*B0.0012CA，即提取时间料液比溶剂浓度。在各试验因素中 ,乙醇浓度和料液比对黄酮类物质提取量的影响达到了显著水平(PAC，即提取时间溶剂浓度料液比。在各试验因素中 ,乙醇浓度和提取时间对黄酮类物质提取量的影响达到了显著水平(P金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌。3. 结论采用超声波辅助法提取罗勒中的总黄酮，工艺设备简单，操作方便，提取时间短，罗勒经超声处理后，使植物组织中的细胞破碎，利于溶剂渗透到植物细胞内部，使细胞中的有
24、效成分进入溶剂中，加速相互渗透，增加了黄酮在溶剂中的溶解，并且破碎过程是一个物理过程，黄酮化合物的生理活性在一定时间内保持不变，是提取罗勒中黄酮类物质的有效方法。用可见光分光光度法测量其含量，通过实验初步探寻提取溶剂、溶剂浓度、提取时间、料液比等单因素提取罗勒中总黄酮的最佳点。进一步利用正交试验验证、确定各单因素的最适实验条件。结果结果表明，在实验范围内，超声提取的最佳工艺条件为：提取罗勒茎中的总黄酮以70%乙醇浓度为最佳溶剂，1:40料液比下超声提取10min效果最优，提取率为62.5%；提取罗勒叶中的总黄酮以50%乙醇浓度为最佳溶剂，1:20料液比下超声提取20min效果最优，提取率为81
25、.9%。黄酮提取物是一种混合物，还含有其他植物天然活性成分，因而不同的提取方法及溶剂都会影响到抑菌效果。本实验初步对罗勒黄酮提取物进行了抑菌生物活性的分析，试验采用滤纸片法测定样品提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的抑菌效果。结果表明：本实验中得到的罗勒黄酮提取液对巨大芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌有一定的抑制作用，对枯草芽孢杆菌无明显抑制作用；对供试菌的抑菌效果依次为：巨大芽孢杆菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌。罗勒中的黄酮对细菌有一定的抑制作用，是一种天然的抑菌剂，可用于医药研究发展。附录图6 芦丁标准液及罗勒提取液的比色法 图7 罗勒提
26、取液图8 定性实验结果图9 抑菌实验结果参考文献1李刚，董自亮.罗勒化学成分和药理作用研究新进展J.亚太传统医药，2013年4月，第9卷第4期.2杨晓军，涂院海.黄花铁线莲根部的化学成分J.中国药科大学学报，2011（2）：112-114.3张鞍灵，高锦明，王姝清.黄酮类化合物的分布及开发利用J西北林学院学报，2000,15（1）：69-74.4王倩，常丽新，唐红梅.黄酮类化合物的提取分离及其生物活性研究进展J.河北理工大学学报：自然科学版，2011（8）：40-41.5米仁沙牙库甫，衣不拉音司马义.罗勒化学成分和药理作用研究进展J.新疆中医药，2007年，第25卷第4期（总第110期）.6买
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