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1、PCR仪器的总结目录目录1一、市场分析21.行业发展情况21.1PCR发展情况21.2整个生物技术产业的发展情况32.相关政策33.市场上的需求34.市场竞争情况4二、技术原理41.基本原理42.系统设备4三、仪器结构51.PCR扩增仪51.1水浴式加热结构51.2半导体式加热结构62.PCR扩增仪的扩展72.1原位PCR仪与PCR扩展仪的比较72.2梯度PCR仪与PCR扩展仪的比较82.3荧光定量PCR仪与PCR扩增仪的比较83.荧光定量PCR仪的主要分类83.1金属板式定量PCR仪83.2各插孔独立式控温定量PCR仪93.3离心式定量PCR仪9四、仪器设计问题101.仪器的现状和发展101
2、.1国际PCR仪技术的现状101.2国内PCR仪技术的现状111.3 PCR仪器技术的发展112.各类PCR仪设计的问题112.1仪器设计相关联的因素112.2PCR扩增仪和梯度PCR仪的技术问题122.3荧光定量检测PCR仪的技术问题13五、结合我们部门综合分析151.研发条件分析（可行性）151.1研发技术及人员的分析151.2研发设备的分析151.3研发成本的分析151.4研发时间及风险的分析162.荧光PCR的展望16附录17附录一17表一：仪器信息网上关于各种PCR仪销售排行榜的相关信息调查表。17表二：网站上公布的现有销售的仪器种类信息。17各种仪器的价格信息18表三：近一年来中国
3、市场上对PCR仪的相应的招标信息18附录二20国内PCR仪器相应生产商20国外PCR仪器相应生产商20附录三22DNA提取方法22附录四24聚合酶链式反应三大步骤的温度时间控制24附录五25荧光PCR检测原理和计算25附录六27Cepheid公司新技术和传统PCR仪比较27附录七28国内外PCR扩增仪和梯度PCR参数对比28国内外荧光PCR仪参数对比29附录八31Peltier器件（常用半导体控温器件）31金属材料的比热容导热系数表32摘要：PCR仪器的主要功能就是实现基因复制和基因检测。仪器内部核心技术：加热模块的材料、结构、升降温速率、温度控制；荧光检测模块的光路结构，总体检测灵敏度。一、
4、市场分析1.行业发展情况1.1PCR发展情况核酸的研究已经有100年历史本世纪60、70年代初人们致力与研究基因体外分离的技术1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想1985年PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明具有划时代意义的聚合酶链式反应。1988年初，Keohanog改用T4聚合酶进行PCR。1988年Saiki等提取到一种耐热聚合酶（目前PCR仪器应用中很重要的一种酶）后来陆续的出现了扩增仪，梯度PCR，荧光定量PCR。生物技术上发展历史比较久远，但PCR仪器的发展只有20年左右的时间。1.2整个生物技术产业的发展情况 科技部长万钢指出中国生物经济“三步走”战
5、略，第一步为技术积累阶段，2010年形成5000-8000亿规模的生物技术产业；第二部为产业崛起阶段，2015年生物产业产值约为16000亿；第三步为持续发展阶段，2020年左右生物产业总产值达到2-3万亿左右，占GDP的4%以上。 生物技术产业按上下游产业划分：上游产业主要是科研试剂的开发，实验仪器研发，试验方法的创新。下游产业主要是把生物技术投入到实际应用中去。生物技术产业的增长速度大致是25%30%，是整个经济增长平均速度的810倍左右。生物技术是中国与发达国家差距相对较小的高科技领域，中国具有发展生物产业的技术基础和巨大市场需求，大力发展包括基因技术在内的现代生物产业，是培育新的经济增
6、长点、提升中国产业国际分工地位和保障国家长远发展的需要。 根据民营医院医疗器械的交易金额统计2008年，国内民营医院的药品器械交易达250多亿元。2.相关政策中国政府高度重视生物产业发展。2009年6月，国务院常务会议讨论并原则通过促进生物产业加快发展的若干政策。会议认为，必须抓住世界生物科技革命和产业革命的机遇，将生物产业培育成为我国高技术领域的支柱产业。以生物医药、生物农业、生物能源、生物制造和生物环保产业为重点，大力发展现代生物产业。促进生物产业加快发展的若干政策的颁布，标志着我国生物产业已步入快速发展期。国家卫生主管部门、国家卫生部门临床检验中心以及国家食品药品监督管理局提倡用户选择国
7、内仪器。因为选择仪器价格只有国外的三分之一左右并且性能接近的国产仪器，能为国家节省大量的外汇，同时能促进国产仪器的技术进步，民族产业的发展。从国内PCR生产商的新闻动态可以看出，国内医疗器械生产企业，只要有自己的专利及发明，而且生产仪器能得到用户的认可，都会受到地方政府的重视，还能申请到一部分科研资金。3.市场上的需求目前市场上的PCR仪的品牌，功能多种多样，给设计PCR仪的方向造成很大的困扰。通过市场的调查可以确定大概的设计方向。（注：市场调查表见附录一）虽然我们没有每年关于PCR仪器具体的销售数量，但是从各种招标网，及仪器信息网上的招标信息，销售排行情况可以了解到市场的需求的变化趋势，国产
8、仪器在市场上占有率的变化。在一个大型的招标网站上每年招标的PCR仪器的数量就有200以上，而招标的仪器中定量PCR仪器占的比重较大，因为招标客户中多数是研究机构，他们对仪器的要求比市场上热卖的仪器的要求稍高，价格也贵很多。根据市场招标信息和仪器信息网上的销售排行显示，目前荧光电量PCR检测仪的需求量在逐渐增大，市场上对原位PCR仪的需求量很小。4.市场竞争情况国内市场上国产PCR仪主要是上海领成，杭州郎基，西安天隆，珠海黑马，杭州博日所生产的产品市场占有率比较高。国内市场上进口的PCR仪主要是美国的ABI，美国的labnet，美国Bio-rad，日本TaKaRa，英国的Techne，德国的Ep
9、pendorf六大品牌占有率比较高。（注：相关企业的介绍见附表二）目前市场上热卖的仪器还是进口的仪器，总体来说进口仪器的市场占有率比国产的高，但是国产的仪器近年来（最近3年的比较情况）在国内市场上的占有率在逐渐提高。应该是国产仪器的技术和国外同类仪器的技术差距在逐渐缩小，而国产仪器的价格上比较有优势。最近出了两款较新的PCR仪，一款是德国的快速基因扩增仪，96个样品循环的时间是812分钟（最近几个月销售排行第一），价格在9万左右，传统的循环时间23个小时，价格在5万左右。另一款就是美国Cepheid公司荧光检测仪，检测的时间是30分钟左右，价格在60万左右。传统的检测时间是23个小时，价格在2
10、0万左右。这两款仪器的特点是把升降温速率提高到了一个新的台阶。二、技术原理1.基本原理PCR中主要的技术就是聚合酶链式反应，聚合酶链式反应的定义：在引物（生物反应所需的添加物）的指导下，由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。PCR通过实验室提取或是DNA提取仪的处理后的DNA样品经过变性、退火、延伸三大步骤多次循环实现DNA大量复制的过程。变性：将反应体系加热至95，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以打开。退火：将温度下降至55左右使引物与模板DNA退火结合。延伸：将温度升至72，耐热DNA聚合酶发挥酶活性，以dNTP（三磷酸脱氧核糖
11、核苷）为底物催化DNA的合成反应。2.系统设备PCR技术只是生物科学应用中的DNA复制技术，应用中它只是系统中的一个中间环节，整个系统的应用主要分两个方向：样品的成分确定（定性检测）；样品的浓度确定（定量检测）。样品的成分确定的主要过程：a、样品中DNA的提取。b、DNA的扩增 c、扩增产物与标本做比较，分析DNA的类别。定性检测系统的设备包括：DNA提取仪（或是在实验室提取）+PCR扩增仪+DNA电泳分析仪。（注DNA的提取方法见附表三）样品的浓度确定的主要过程：a、样品中DNA的提取 b、在DNA扩增的过程中检测DNA双链数量的变化来推算样品DNA浓度。定量检测系统的设备包括：DNA提取仪
12、（或是在实验室提取）+荧光定量PCR仪三、仪器结构1.PCR扩增仪由以上的资料可知PCR扩增仪的功能单一，只是实现DNA的复制。而难点就在于在DNA复制的三大步骤中温度和时间的控制。（注：变性、退火、延伸温度时间的参数控制见附表四）PCR扩增仪的结构上的发展过程（主要是温度控制模块结构上的变化）根据加热材料的不同可以分为：水浴控温和半导体控温根据控温方式的不同可以分为：恒温模块不动，移动样品和样品不动，改变样品周围环境的温度。1.1水浴式加热结构加热模块不动移动样品图1水浴式加热框图及仪器特点：DNA复制三大步骤所需的三段温度分为三个水浴区，通过移动试管到不同的水浴来改变反应的温度（需要机械臂
13、操作）。缺点：自动化程度低，移动过程耗时多，移动的过程中容易导致非特异性产物的产生优点：温度均一性好（装样品的试管和液体充分接触）水浴式加热结构的改进图2水浴式加热结构的改进这种结构的工作原理：上图为圆柱形水浴槽，分为高温变性恒温槽2，低温退火恒温槽3，中温延伸恒温槽4 三个恒温槽。每个恒温槽有单独的加热丝5和温度传感器6控制温度。DNA样品液通过进样毛细管口1，进入恒温槽，通过绕在立体柱面8上的螺旋形毛细管内流动来实现反应中的温度转换。循环的次数是由螺旋管的圈数决定。1.2半导体式加热结构样品不动，改变周围环境温度图3 半导体加热的内部结构图和仪器特点：如左图所示，金属板上设置插槽5，放置样
14、品。插槽下端有水流管11，供制冷剂或液体流动降温。插槽周围金属块内镶有加热元件和温度检测元件实行恒温控制。缺点：温度均一性差。优点：便于集成，测试样品的数量大，温度的改变的速度较快容易控制半导体恒温模块不动，移动样品 图4 移动样品实现DNA复制的结构图这种结构的工作原理：在金属的基板上实现不同区域的温度控制如金属块的上边沿15为变性所需温度，下边沿16为退火所需的温度，中间区域13为延伸所需要的温度，样品通过毛细管进样口11在毛细管道中流动来实现温度的转换，循环次数由毛细管形状结构重复的次数决定。2.PCR扩增仪的扩展由于目前普通的PCR扩增仪器相对于整个定量，定性检测系统的自动化程度并不高
15、，人们为了扩展它的应用范围在原有扩增仪的基础上添加了更多的功能就出现了以下几类PCR仪。PCR扩增仪原位PCR仪梯度PCR仪荧光定量PCR检测仪 图5 PCR仪的类型2.1原位PCR仪与PCR扩展仪的比较主要不同点在以下几个方面比较的类型PCR扩增仪原位PCR仪样品材料提取细胞或组织中的DNA液细胞或组织样品的容器试管载玻片仪器的结构主要功能检测到靶DNA检测到靶DNA的同时还能了解靶DNA存在于何种细胞中，便于探讨靶DNA于细胞之间的关系。由于原位PCR仪器功能的特点，原位PCR仪的应用范围主要是以下几个方面：（1）检测外源基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV，HPV、HB
16、V、CMV等；（2）观察病原体在体内的分布规律 （3）内源基因片段，如人体的单基因病，重组基因、易位的染色体，Ig的mRNA片段、癌基因片段等（4）检测导入基因 （5）遗传病基因检测。2.2梯度PCR仪与PCR扩展仪的比较梯度PCR仪与PCR扩增仪器最大的不同就是在温度的控制上，梯度PCR仪主要是能在基因扩增的退火的过程中能够实现温度在某一区间范围内阶梯的控制，如研究某以样品的最适合的退火温度，在退火的过程中实现温度从45到55阶梯变化，通过一次扩增找到样品最适合的退火温度。2.3荧光定量PCR仪与PCR扩增仪的比较荧光定量PCR检测仪就是在PCR扩增仪器实现DNA复制的过程中对产物实时检测，
17、通过产物数量的变化曲线来推算样品初始的DNA拷贝数。（注：荧光检测的原理和初始DNA拷贝数的计算方法见附录五）3.荧光定量PCR仪的主要分类金属板式定量PCR仪，各插孔独立控温的定量PCR仪和离心式定量PCR仪。3.1金属板式定量PCR仪在整个样品槽的上端多一个荧光检测设备如下图所示图6荧光检测的光学结构图荧光检测的光学结构工作原理：如图所示荧光的激发光源的通过设定的光路照射到样品孔板里被荧光染料或荧光探针标记的产物，使得产物发出荧光，通过一定的回路到达光敏接收器。再经过相应的软件工具在电脑上拟出光信号的变化曲线。图7目前市场上现有仪器的外形仪器的荧光检测设备在仪器的热盖中3.2各插孔独立式控
18、温定量PCR仪这种PCR仪的特点就是金属板的设计上，把样品插槽单独分开，每个插槽能独立的控制温度变化，这样的设计能同时测量更多种类的样品，提高检测的效率。 图8 目前市场上现有的仪器外形3.3离心式定量PCR仪用空气作为加热的介质，温度均一性好，温度改变速率块。使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差；可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。 图9目前市场上现有仪器的外形 图10 离心式定量PCR仪的内部结构四、仪器设计问题1.仪器的现状和发展1.1国际PCR仪技术的现状Cepheid公司与传统的PCR仪生产商不同，没有经历
19、化学法到免疫标记法，再到PCR技术这样的发展阶段，而是直接从一个全新的平台上开发PCR仪，在仪器设计理念上突破传统的96孔板设计，采用了独立的反应槽;开创独特的样品制备系统，采用微珠试剂。传统的PCR实验，需要对样品进行裂解、核酸提取、纯化及浓缩等繁杂的样品制备，通常耗时2-3小时，而Cepheid公司的GeneXpert PCR仪包含微流样品管、超声装置、注射装置、旋转装置、直角光路设计的特殊定量PCR反应管等几个部分，将样品制备和实时定量PCR反应全部自动实现，从样品制备到完成测试最快仅需30分钟左右，大大缩减了样品的制备时间，消除了操作中的人为误差，提高了反应结果的准确性，并且大大减轻了
20、操作人员的工作强度。（注：Cepheid公司新技术和传统PCR仪比较见附录六）1.2国内PCR仪技术的现状以PCR仪为仪器平台的分子诊断技术虽然是分子诊断技术中应用广泛并比较成熟的技术，但是还存在一些局限：(1)尽管方法简单，但是操作过程复杂，特别是样品的制备过程，对操作人员的要求很高;(2)很容易被“污染”，PCR技术具有高特异性、高灵敏度的优势，但这些优势也常常成为PCR技术的“烦恼”，环境中的病菌或操作人员的一点失误都会被几何级数的放大，造成检测结果的“假阳性”。（注：国内外三大类PCR仪参数对比见附录七）1.3 PCR仪器技术的发展 普通的基因扩增仪需求量大，但技术上相对很成熟，就像德
21、国的快速扩增仪一样，他们把升降温速率提高的一个新的台阶，国内的仪器要做到这样的技术还需要一定的时间。目前PCR仪的升温速率最快的仪器，在技术上的发展应该受到很大的限制，再想提高这种技术比较困难。他们也只能等待其他竞争者逐渐的减少这种技术差距。PCR技术应用的领域变的更加广泛，从简单的基因复制到疾病的诊断，免疫学，法医的鉴定，考古的应用，环境检测，食品检测，植物学，动物学等等。随着技术的不断发展，PCR技术的不断成熟，可能在几十年后，如果个人电脑里存有绝大多数的病原的基因序列，加上一个定量定性检测的PCR仪，用户自己就可以检测出生了什么病，病情的程度（病原在体内的浓度），及治疗的方法。2.各类P
22、CR仪设计的问题2.1仪器设计相关联的因素样品种类PCR仪功能试剂盒仪器结构和所需器件仪器及元器件材料 图11仪器设计过程中制约条件的结构图PCR反应所需要的反应材料PCR扩增仪和梯度PCR：试剂盒，引物，模板荧光定量PCR检测：试剂盒，引物，模板，荧光标记物（荧光探针或荧光染料）一般的试剂盒包括：TapDNA聚合酶，4种dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷）混合物，Mgcl2，反应缓冲液，PCR增强剂，上样染料等PCR所需要的成分。很多试剂盒是通用的，不同的模板或样品需要设计不同的引物，及不同的荧光标记物。有专业的公司负责设计荧光标记物和引物。荧光探针大部分是需要的时候才合成，提前合成的荧光探针会衰
23、变。 有关制约因素的结构图的解说如下：PCR仪器反应模块的不同同时测试的样品总类的数量就不同不同的样品在PCR扩增中需要添加不同的引物（现在PCR反应的所需的引物和模板都有相应的试剂盒）如果仪器有定量检测的功能就要求试剂盒里包含荧光标记物仪器功能结构的不同就要求装载试剂盒及反应液的试管的大小，试管壁的厚度，及试管壁的透光性满足一定要求。2.2PCR扩增仪和梯度PCR仪的技术问题1、结构上的问题：a、主流的仪器是半导体技术控温，而样品插槽的直径和深度不知道设置多大的数据合适，试管的大小，材料及装样品的量会影响热传的效率，试管太小（毛细管）会增大样品的贴壁量。2、半导体材料的选择问题：目前主流的半
24、导体加热技术是应用peltier器件，材料的主要选择方式是热导率高（传热速度快），比热容合适（升高相同的温度需要的能量较少温度容易控制），目前满足上述条件的材料主要有铝、铜、金、银。合金种类太多具体参数值不清楚，现有升降温效率较高的仪器所用的材料是铝，银或镀金的银。（注：peltier器件资料和金属材料的比热、热导率数值表见附录八） 3、加热元件的选择。目前升温较快寿命较长的加热元件是PTC热敏电阻加热元件，还有普通电热丝导热管，没有整体的样品槽结构，就没法选择电热元件的性能参数和尺寸。 4、 图12 梯度PCR仪的实图 大部分的梯度PCR仪温度控制是在循环的时候每列设置一个不同的退火温度值，
25、如图12所示，图中间的样品孔，96孔12列8排，这种就可以设置12个温度梯度值，每一列的8个孔退火时候的温度一致，结构设计的时候每一排要单独分别实现恒温控制。循环结束后就知道那一列的退火温度是最适合温度。 5、升降温速率的理论值计算：升降温的速率和加热元件功率，及金属板材料及结构有关，先设计好了结构，再选择加热元件（PTC热敏电阻可以按要求的尺寸，形状主要是圆片，圆柱，环状），才能有个初步的计算。 上面5点主要是针对目前大多数使用仪器的结构设计问题。如果是针对移动样品来实现循环的如图2和图4主要技术问题有以下几点： 1、 因为是样品在仪器的毛细管里流动，为了减少样品间的交叉污染，要针对不同的样
26、品设计不同点毛细管，不同温度区域里的毛细管的长度，和毛细管结构重复的数量都得单独设计。2、毛细管制作材料有较高的要求，不能用硅表面（会杀死部分酶的活性），也不能用塑料，而且毛细管壁需要特殊的镀层。具体用什么材料最好-现在还不清楚。毛细管的管径和流速有一定的关系具体什么要求不清楚。3、此类设计由于样品始终在流动，目前的荧光检测都是用光照射静止的样品，当样品流动时不知对检测结果会有怎样的影响，如果要扩展成定量检测，可以在每个流动结构的延伸的毛细管处方安装荧光检测装置，数据处理的方式不一样。不知道毛细管管壁是否会贴上流过的样品，是否会对荧光检测造成很大的影响。2.3荧光定量检测PCR仪的技术问题如果
27、荧光检测采用如下的光路图 图13半导体加热板上通过同轴光纤来传导荧光的激发光源和被激发的荧光的光路图1、像这种结构需要在半导体加热板中安装同轴光纤传导来传导光线，同轴光纤的需要管径大小不清楚（这种光路结构是申请过专利） 如图6所示半导体加热技术的荧光定量检测的光学结构图（升降温速率问题和PCR扩增仪及梯度PCR仪器的问题一样） 2、因为荧光定量检测的样品不同涉及到不同的荧光标记物（荧光探针或荧光染料）不同的荧光标记物在延伸阶段的产物激发的荧光的波长有区别，所以再选择光源之前要事先想到你要设计的仪器能检测哪些类荧光标记物，才能确定光源的波长范围及激发后的荧光的波长范围。 3、光源的选择又和结构设
28、计上有很大关系，设计中光源安装位置的温度和空间大小影响选择光源器件的耐温和尺寸参数，滤光镜可以按要求定做，使得滤光镜能达到过滤后得到想要波长的效果，但光源强度的选择不清楚，不知道光源强度对检测有什么影响。目前的光源主要也有两类，LED和卤钨灯。LED等的寿命比较长，价格便宜，但是关于led灯角度（大角度散光。小角度聚光），光通量，光强度的选择不清楚。（注:荧光检测原理见附件中的PPT资料。荧光知识的相关了解，仪器分析网络课程： 如果荧光检测是应用图10的结构（通过加热的气体来改变试管周围环境温度）4、用气体做热传导的介质是目前升降温速率最高的。气体做介质恒温控制难度较大，如图所示，管口的大小，
29、通气的速率，恒温控制的快慢直接影响加热线圈的形状及功率的选择，变温的时候是控制空气的流速好，还是改变加热线圈的功率好，不清楚。 5、为了让试管与空气充分接触，装载样品的载台，是要求旋转的，旋转的速率和荧光信号检测之间的数据处理具体关系不清楚。 6、光敏接收器件的选着主要有两类，光电倍增管（PMT）和CCD的选择。各有优缺点，CCD便于处理大量数据，价格比PMT贵十几几十倍，坏了更换方便。PMT的灵敏度更高，价格便宜，更换不变（不知道结构上的改变能否解决这个问题）。现在不确定荧光检测到底要多高的灵敏度才能满足要求。根据仪器的结构和器件类型可以用虑光片或光栅来滤出特定波长范围的光线。日本滨松光子学
30、株式会社将会在2011推出新一代的微型光电倍增管，与传统的圆柱式光敏器件不同，它是集成芯片式的PMT，体积大大减小，功能不变。也有少量仪器选用CPM（端窗式光电倍增管）不易被磁场干扰，检测比PMT更灵敏。五、结合我们部门综合分析1.研发条件分析（可行性）1.1研发技术及人员的分析 我们的合作伙伴里应该有生物技术专业人员（PCR技术），和PCR仪器维修的人员。便于在仪器的设计过程中咨询相关的生物技术问题，和各种元器件的选择问题。 研发人员中缺少有加热器械结构设计的人员，光学专业人员。这不光是结构上的设计，还要尽可能考虑到结构的传热性和温度的均一性；总结里提到的现有的光学结构图都是有专利的，我们只
31、有设计更新颖，更好的结构才能满足仪器的要求。 整体上提高检测的灵敏度，检测过程中有大量数据要处理软件设计的难度也比较大，现有软件设计人员短时间很难设计满足要求的软件。1.2研发设备的分析 我们只有一个电子原器件的实验室，在光学设计和加热模块的设计时，现有的实验室不能满足要求，理论的计算、设计后很难在试验中得到验证。1.3研发成本的分析荧光PCR仪器所需元件（比较贵的元件）的大概成本。 滤光镜，按要求订做一个滤光镜 需要8000元（生产数量超过100的时候成本在200左右），而每个荧光通道需要两个滤光镜。 光电倍增管（PMT）每个价格大概在500左右。 CCD满足PCR检测要求的价格大概在1万左
32、右。 加热设备，选用PTC加热器的成本一个加热模块的成本在200左右。 半导体加热材料，如果选用目前升温速率最快的材料镀金纯银，及模型的加工费。还不清楚。 按照招标网站上仪器（要求比热卖仪器稍高）的信息一台4通道的一套荧光检测设备的价格是40万左右，要求高的5通道的价格有六七十万以上的。研发的成本：材料的成本应该在15万以内，技术上的成本不清楚，批量生产的成本还会降低很多。1.4研发时间及风险的分析 我们没有相关的设计经验，根据目前的条件研发此类仪器需要较长的时间。而国内PCR仪器生产商相对于同类企业在国内市场占有率比较大的至少有5年以上的经验，其中还有十几年的老企业。我们的仪器出产的时候他们
33、之中的强者的品牌效应可能已经深入人心。2.荧光PCR的展望目前的荧光PCR仪检测灵敏度上还有较大的提升空间，因为现在即使用高灵敏度的CMP（光电倍增管）也很难提高整体检测灵敏度，这个和光路结构和软件数据的处理有很大关系。升温速率最快的离心式PCR仪的以空气为加热介质虽然速率上有很大的提高，但由于结构设计的缺陷，测量的样品较少，样品在同一空间内很难做到梯度的功能。如果结构上的设计有很大突破，提高检测的自动化程度，减少样品的污染整体上提高荧光检测的灵敏度高灵敏度的检测下稍有污染，就会使误差增大。附录附录一表一：仪器信息网上关于各种PCR仪销售排行榜的相关信息调查表。PCR仪器类型2008年上榜情况
34、2009年上榜情况2010年上榜情况国产总量国产总量国产总量PCR扩增仪35212611353梯度PCR仪0300301133荧光PCR仪153811291024表格信息补充：仪器信息网上有每个月前10名PCR仪器的销售排行，每年会有120款仪器上榜，从排行榜只知道不同类型仪器的销售排名，没有具体某种品牌仪器的销售数量。 表格信息说明：目前中国市场的仪器销售进口的产品在中国的销售情况占有一定的优势，从表格数据可以看出国产仪器在整个仪器销售中的比例在逐渐增大。表二：网站上公布的现有销售的仪器种类信息。 表格统计的数据信息补充：进口仪器大部分是美国的，英国和德国的仪器也不少，还有少量日本和韩国的仪
35、器。销售商主要集中分布在上海，北京，天津，广东，杭州，成都等地。国内市场上国产PCR仪主要是上海领成，杭州郎基，西安天隆，珠海黑马，杭州博日所生产的产品市场占有率比较高。国内市场上进口的PCR仪主要是美国的ABI，美国的labnet，美国Bio-rad，日本TaKaRa，英国的Techne，德国的Eppendorf六大品牌占有率比较高。各种仪器的价格信息因为PCR仪器由普通PCR仪，梯度PCR仪，及实时荧光定量检测的PCR三大类构成。每一类的价格和仪器同时测量样品的数量和模块的数量成正比，具体型号种类很多。下面只是关于PCR仪器价格的大概统计。国产的普通PCR仪价格范围大概在180003500
36、0元国产的梯度PCR仪价格范围大概在2600045000元国产的荧光PCR仪价格范围大概在150000300000元进口的普通PCR仪价格范围大概在3500050000元进口的梯度PCR仪价格范围大概在4500080000元进口的荧光PCR仪价格范围大概在200000500000元表三：近一年来中国市场上对PCR仪的相应的招标信息不同的省市普通PCR仪招标量梯度PCR仪的招标量荧光定量PCR的招标量各地区招标的总量北京861529广东452029浙江322429湖北541019江苏041418福建301316上海01910安徽0156河南044河北0033吉林0246四川1135内蒙古0044
37、山东2024甘肃0213天津1056辽宁0022江西0112山西0011宁夏0011湖南0011重庆011新疆1001各个型号PCR招标的总量2829143200 表格的数据信息补充：在这一年中所有的发出招商信息的客户中，医院，疾病预防控制中心，各研究院和大学实验室占多数。在招商的信息中都会给相应仪器的要求的详细的参数。有的客户要求中会直接注明要进口的仪器。从表格的数据可以看出，目前需求量最大的还是荧光定量PCR仪，北京，广东，浙江等地区需求量比较大。各个行业应用的范围不同所要求仪器的参数指标也不同。附录二国内外PCR仪器生产商信国内PCR仪器相应生产商企业名称企业特点企业类型西安天隆科技有限
38、公司十几年生产PCR仪的历史，PCR仪是他们的主要业务，PCR仪的种类很多，其生产的PCR仪相对于国内的其他生产商销量第一，公司相应试剂盒是国外进口自主生产加工上海比朗仪器有限公司生产各种实验室仪器，PCR仪只是其中一个业务生产加工陕西鹏展科技有限公司生产部分生物仪器，并代理新加坡的梯度PCR仪，及日本的原位PCR仪，PCR扩增仪生产，代理销售杭州朗基科学仪器有限公司生产生物仪器，PCR仪器是其主要业务。PCR仪分为原位、多功能、梯度自主生产加工杭州晶格科学仪器有限公司主营分析仪，医学检验仪，食品安全检测仪生产加工国外PCR仪器相应生产商企业名称企业特点补充信息罗氏公司全球诊断领域排名第一 全
39、球肿瘤领域排名第一 移植学和病毒学领域的领先者 全球生物科技领域排名第二德国eppendorf 公司世界上实验室生物技术设备领域的著名生产厂商BIO-RAD公司 产品主要针对生命科学，临床诊断两大领域。PCR产品做了6年，生产研发各种PCR仪和各种试剂盒网址www.bio- 公司的PCR仪中有设反应模块，根据需要模块具备梯度PCR，双反应槽，载玻片PCR，自动调节等热盖功能。同一底座可以加不同功能PCR反应模块。美国ABI 世界上规模最大、销售额第一的生化仪器、分析仪器公司之一。基因组及基因研究、SNP研究 、基因表达分析、蛋白质组研究 、新药开发等领域。网址 公司主页上有部分仪器的操作过程的
40、视频，视频里会介绍仪器大概的结构。美国Cepheid公司PCR仪的技术比较新网址 PCR仪是目前自动化程度最高，用时最少的仪器。附录三DNA提取方法方法简介：为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。 动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。 微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，
41、提取时易保持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大，一般达210 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。1.核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的D
42、NA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度会受到盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度会受到盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白2.细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法
43、有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： 破碎细胞难；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。 分子量大，一般比细菌的大23个数量级，比病毒的大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。3.DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 利用RNP和DNP在电解
44、溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA. （3）.苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表
