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1、新药研发中药物分析方法建立与验证,袁艳娟2015.04.17,2023/3/10,2,分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求药物分析应用示例,内容提要,2023/3/10,3,第一节 分析方法的设计依据,建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件,2023/3/10,4,一、待测药物的理化性质及体内存在状况,准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物预处理待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法首先应考虑待测药物的理化性质药物在生物体内的存在状况药物在生物体内的生物转化(代谢)途径,20
2、23/3/10,5,(一)待测药物的理化性质,药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等具有挥发性GC测定法具有光谱或电化学特性分析检测方法药物的稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂对热不稳定避免高温蒸发溶剂,2023/3/10,6,(二)待测药物的体内存在状态,与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低分离萃取方法蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术浓度较低（尤其有代谢产物共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用LC-
3、MS等分析检测技术,2023/3/10,7,二、分析测定的目的与要求,药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求同时测定原形药物和代谢产物检测宽线性范围(CmaxCmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)方法不必强调方法的简便、快速；大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 毒代动力学确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围,2023/3/10,8,三、生物样品的类型与预处理方法,生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样
4、品蛋白沉淀 溶剂萃取分析样品较为“干净”，可用HPLC或HPLC-MS检测,2023/3/10,9,四、实验室条件,在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。,2023/3/10,10,第二节 分析方法建立的一般步骤,一、分析方法的选择二、分析方法的建立(一)检测条件的筛选(二)分离条件的筛选,2023/3/10,11,一、分析方法的选择,体内药物分析方法的设计生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少难以通过增加取样量提高方法灵敏度通过选择适当的分析方法适应样品分析需求,20
5、23/3/10,12,二、分析方法的建立,分析方法建立之前查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定,2023/3/10,13,二、分析方法的建立,初步拟定分析方法后进行一系列试验工作选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的 分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选,2023/3/10,14,(一)检测条件的筛选,标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC 调整检测器(类型、
6、条件)色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)流动相(组分及其配比)及其流速 柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)良好的色谱参数(n、R、T)适当的保留时间(tR),2023/3/10,15,(二)分离条件的筛选,在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)2空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性)3模拟生物样品试验 方法效能指标4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性),2023/3/10,16,2.空白生物基质试验,空白生物基质(b
7、lank biological matrix)如空白血浆 考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号,2023/3/10,17,3.模拟生物样品试验,模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物考察目标方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性,2023/3/10,18,4.实际生物样品的测试,空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能
8、完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)实际生物样品确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试考察目标代谢产物对药物、内标物质的干扰情况进一步验证方法的可行性,2023/3/10,19,第三节 分析方法验证的内容与要求,验证步骤：首先为分析方法的验证 特异性、精密度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环,2023/3/10,20,验证的效能指标与基本要求,1特异性避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际
9、状况相符4精密度结果可重现5定量限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度 8.基质效应,2023/3/10,21,一、方法特异性(专属性或选择性),方法的特异性(specificity)系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力比较待测药物或其活性代谢产物检测信号对照品（或标准品）空白生物基质模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）确证内源性物质对分析方法有无干扰,2023/3/10,22,二、标准曲线与线性范围,标准曲线（standard curve）calibration curve or working curve标准曲线用模拟生物样品建
10、立线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备,2023/3/10,23,标准系列溶液的浓度范围,至少含59个浓度点(不包括零点,即空白)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)实际制备时：500、250、100、50、20、10,2023/3/10,24,标准系列模拟生物样品的制备,空白生物基质(如血浆)加入
11、标准系列溶液适量，涡旋混匀为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失先加入标准溶液 再加入空白生物基质 涡旋混匀,2023/3/10,25,标准曲线的限度要求,药代动力学或生物利用度研究标准曲线至少包括5个浓度(通常为59个浓度,不包括零点)最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%5%，并应为方法的LOQ(非LOD)相关系数要求 0.99(色谱法)低浓度点准确度为真实值80%-120%，其余点为85%-115%。,2023/3/10,26,三、准确度,方法准确度(accuracy)系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，
12、但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定,2023/3/10,27,四、精密度,方法精密度(precision)系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.12ml)使用模拟生物样品测定,2023/3/10,28,1.表示方法,方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD=包括批内(within-run或int
13、ra-assay)RSD日内(within-day)和批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between-day，day-to-day),2023/3/10,29,2.测定法分别测定法(),照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD每一浓度5个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD批间RSD每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度3个分析批数据)的RSD,2023/3/10,30,3.限度要求,在药
14、代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ附近RSD应20%。,2023/3/10,31,五、定量限,方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)要求应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度准确度在80%120%(或RE在20%的范围内)RSD20%,2023/3/10,32,六、稳定性与质量控制,稳定性包括方法稳定性和样品稳定
15、性方法稳定性方法的耐用性样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻-融循环测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察要求准确度85%115%(RE在15%范围内)，RSD15%,2023/3/10,33,七、提取回收率,生物样品的预处理方法提取回收率，70%取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次另取等量的相同3个浓度的含药血浆，经提取处理后同法测定,八、基质效应,基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。取空白生物基质(如血浆)与空白溶液对比，照
16、准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次,2023/3/10,35,第四节 药物分析方法应用示例,供试品A进行生物等效性研究文献调研：性质：物理性质溶解，配制吸收过程血药浓度蛋白结合率提取方法代谢分析方法预处理方法,根据文献调研结果开展实验,1、确定检测方法2、确定内标3、确定检测离子对（分子量扫描）4、确定分析及提取方法,2023/3/10,36,5、分析方法优化：色谱柱流动相：水相（盐，酸），有机相（甲醇，乙腈）柱温流速6、提取方法优化：蛋白沉淀：甲醇、乙腈、三氯乙酸液液萃取：乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚等进行预实验、方法学验证,新药分析方法建立,溶解性、配制方法、稳定性分子量扫描、确定离子对、内标建立初步分析方法尝试提取条件优化方法学初步考察预实验（血药浓度、半衰期、代谢产物等）方法学验证正式试验,谢谢大家！,
