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1、红豆杉优良品种选育及快速繁殖一、 项目的立项依据（研究意义，国内外研究现状及分析） （一）项目摘要 癌症,已成为严重威胁人类健康的主要病症之一，每年约有600万新的病例被报道，其引起的死亡率占所有疾病死亡率的第二位，仅次于血管疾病。由于癌症早期诊断的困难，相当数量的癌症患者将依赖药物治疗，紫杉醇(paclitaxel，商品名TaxoD，因其独特的作用机理，成为新一代抗癌药物的代表。它是从红豆杉属植物（Taxus L.）中分离出来的红豆杉属植物（Taxus L.）特有的次生代谢产物二萜生物碱,是最具抗癌活性的天然化合物之一。因其独特的抗癌机理及高效、广谱的抗癌效果，被广泛用于治疗妇科癌症(如转移
2、性乳腺癌、晚期卵巢癌、宫颈癌等)、呼吸道及消化道癌症(如小细胞肺癌、胃肠癌、食管癌等)、恶性肿瘤(如头颈部肿瘤、恶性黑色素瘤、淋巴肉瘤、恶性滋养细胞肿瘤、与抗艾滋病药物合用还可治疗卡彼济氏肉瘤(一种艾滋病人特有的恶性肿瘤)、自身免疫系统疾病(如类风湿性关节炎、疟疾等)以及中风、早老性痴呆和先天性囊肾病等，具有其他抗癌药物难以达到的疗效。紫杉醇高效而广泛的用途使其成为世界销量第一的抗肿瘤药物,紫杉醇以针剂为主，由于该药疗效确切、副作用小，在美国上市后销售情况一直很好。市场对紫杉醇的强烈需求导致红豆杉原料的严重短缺。因此，对红豆杉的研究成为世界性关注的热点，但不论从红豆杉的繁殖方法还是获取紫杉醇的
3、途径来看，红豆杉的资源问题仍是制约紫杉醇数量的首要问题，而良种红豆杉的选育快繁是解决紫杉醇药源红豆杉严重匮乏的根本途径：从云南各地州采集红豆杉样品，由于云南红豆杉遍布云南各地州（南至中缅边界，北至金沙江畔，东至文山，西到保山），分布零星，多为散生，极少纯林。本项目选择的样本为当地有代表性植株，样品阴干后进行紫杉醇、10-DAB和巴卡亭IIl的含量测定，从选取的样品中选择最高含量的植株（或者是紫杉醇含量最高、或者是10-DAB含量最高或者是巴卡亭IIl含量最高，或者是二种以上物质含量都高的植株）作为母本，设计红豆杉组织培养方案进行组织培养，组织培养主要分以下三步进行：1、诱导愈伤组织；2、从获得
4、的愈伤组织中诱导芽分化；3、切取分化的芽进行生根培养。获得的无菌苗经练苗移栽后，剪取枝叶，检测2-3年生幼苗中紫杉醇、10-DAB和巴卡亭IIl，确认无变异且是高含量植株后，进行快速繁殖。目前，紫杉醇主要从红豆杉属植物中提取，这将破坏野生资源和生态环境，而且天然红豆杉在世界范围内数量很少，生长周期长，紫杉醇含量不一致，种子繁殖慢（大约需要两年才能发芽）、难繁殖，从而对紫杉醇的进一步开发利用造成了很大的困难。在今后的很长时间内紫杉醇、多烯紫杉醇、10-DAB和巴卡亭IIl的稳定供应，将依赖于生物学方法，即通过红豆杉的人工栽培来获得。筛选高产红豆杉栽培品种，利用植物组织培养技术进行无性繁殖，解决红
5、豆杉天然资源不足的棘手问题，具有成本低、高效率、生产周期短、无性遗传特性一致的优点。红豆杉的组织培养经过数十年的研究，已取得了极大的进展，目前有南方红豆杉、中国红豆杉、曼地亚红豆杉等的组织培养成功的报道。（二）立项的必要性红豆杉极高的经济价值，令世人瞩目。然而，红豆杉在世界范围内的自然资源却很贫乏，且紫杉醇含量极低（仅为干重的 0.01%左右），大约从 56 棵 100 年生大树中才能提取到 1g 紫杉醇，可用于一个癌症患者的治疗。因此，要满足临床需求必须大量砍伐红豆杉树。1991 年，美国国家癌症研究所（NCI）为获得 25kg 紫杉醇毁树38000 株。2006年全世界所需紫杉醇原料药至少
6、700公斤左右，并且每年还以20的速度增长，而全球只有400公斤的生产能力，基本上当年的产品就被全部消耗掉（无库存产品）。自1992年紫杉醇上市以来，中国的野生红豆杉资源大约被破坏掉80%。伐树生产紫杉醇的方法不仅会使红豆杉植物资源濒临灭绝，也根本无法满足人们对紫杉醇的需求。如何在保护天然红豆杉资源的同时又能提供能够满足市场对紫杉醇的需求，进而解决紫杉醇资源的稳定供应问题，降低癌症治疗费用。近十年来，国内外学者为了解决该问题进行了许多研究工作， 主要有：（1）植株栽培法：即通过杂交的方法，获得生长周期短、紫杉醇含量高的红豆杉新品种，国内外都建立了红豆杉种植园，并且紫杉醇的含量不低于野生植株，取
7、得了一定的成效。但受土壤、气侯、季节等的影响，难以大面积堆广。（2）全合成法：紫杉醇结构复杂，母核有9个手性中心，侧链有2个手性中心，因此应有2048个非对映异构体，它的合成过程复杂，虽然原料便宜，但是需要有25道程序 ，难度较大，成本太高，要真正用于工业生产紫杉醇还需时日。（3）半合成法：利用在植物中含量较大的紫杉醇前体物化学转化成紫杉醇。通常以10-DAB 和巴卡亭为原料半合成了紫杉酵以及同系物taxotere，红豆杉针叶资源丰富，再生能力强，半合成工艺实验室己趋于成熟，因此半合成被认为是扩大紫杉醇来源的有效途径。（4）真菌培养法：从红豆杉的树皮中分离出来产生紫杉醇的内生真菌，通过发酵大规
8、模生产。目前，由于获得含有紫衫醇的真菌较困难且真菌培养液中只能获得纳克培养，离产业化生产还很远 。（5）细胞培养：根据细胞全能化的观点，采用少量的红豆衫植物繁殖材料，通过组织培养获得植物原料提取可大量生产紫杉醇。红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇虽取得了一定的成果，前景也非常乐观，是紫衫醇的一个有希望的长期资源，但仍有很多问题需进一步研究。在紫杉醇生产体系中存在细胞增殖与产物积累的冲突，并且细胞生长状态及生产能力变化很大，难于控制，成本高昂，极大地限制了培养工作。其主要原因是存在对紫杉醇合成机制缺乏足够的了解，真菌自身合成紫杉醇的途径还未见报道,自身是否存在紫杉醇的合成途径还需进一步研究探索.此生
9、产方法的前景还不明朗。国际市场上目前仍沿用十年前确立的紫杉醇原料药两大制备方法(即红豆杉树皮提取法和树枝提取一半合成法)。迄今为止尚未见有第三种方法形成大规模工业化生产的报道。云南省是我国红豆杉资源的主要分布区域，其中云南红豆杉 (Taxus yunnanensis)在所有红豆杉中无论株数或蓄积量都在99.6以上。另外云南红豆杉的紫杉醇含量在各红豆杉树种中较高，且其植株体内的含有丰富的10-去乙酰巴卡亭（10-Deacety Baccatin）和巴卡亭（Baccatin ），它们均是紫杉醇半合成中的前体原料。因此，云南红豆杉已成为我国紫杉醇药物生产的主要树种。但据数据分析统计显示云南红豆杉以零
10、星分布为主，在缺乏群体优势的前提下，其生存环境受其他伴生树种的严重影响，故而维护个体生存的能力脆弱，加之其他因素，使其处于濒危状态属珍稀濒危树种。为了满足人们对紫杉醇的需求，目前大多采用化学合成、细胞工程及微生物工程等多种技术寻找高效、廉价、优质的紫杉醇生产途径，试图解决红豆杉资源匮乏的问题，但至今尚未得到理想结果。近年来许多研究表明红豆杉的枝、叶中均有紫杉醇。因此，人们十分重视通过栽培法解决红豆杉资源匾乏的问题。美国已选育出适于人工栽培的红豆杉新品种。本项目通过对云南红豆杉进行组织培养，优化各种培养条件，培育优良栽培品种，进一步提高紫杉醇含量，可以摆脱从天然林中获取扦插穗条的依赖，做到完全的
11、原料人工化栽培，达到红豆杉植物资源的保护和进行抗癌药物生产的双重目标，以求实现红豆杉紫杉醇产业的可持续发展。同时，在人工栽培中，选择优良的红豆杉品种建立优质的红豆杉人工种植基地将是获取紫杉醇最经济、最现实的途径。建立大规模的云南红豆杉人工繁育和种植基地，将能够有效解决紫杉醇原料短缺的问题成为我国乃至全世界人类健康事业的福音。推广种植云南红豆杉，一方面带动农民实现其产业化的生产，保护我国的红豆杉资源，增加农民收入，富裕一方百姓；另一方面加大紫杉醇在医药领域中发展空间。有利于人类健康事业、有利于我国生态环境保护工程的顺利进行。（三）国际水平、现状及发展趋势 红豆杉属植物全世界有l1种，分布于北半球
12、温带至热带地区。美国、加拿大、法国、印度、缅甸和中国等地都有分布，但属亚洲的储量最大，其中中国的红豆杉就占全球储量的12以上，资源相对较为丰富。但随意采伐红豆杉提取紫杉醇使我国的野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏，80%的红豆杉资源严重被毁，红豆杉已成为濒危的珍贵树种。然而，目前人们对紫杉醇的需求日益增加，为了解决紫杉醇的供求矛盾，国内外已通过生物技术、组织与细胞培养等各种途径来缓解红豆杉资源的不足。利用离体培养的红豆杉组织和细胞生产紫杉醇及其合成前体是扩大紫杉醇来源的一条重要途径，它具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。目前国内外研究较为集中的是欧洲红豆杉、短叶红豆杉、东北红豆杉、云南红
13、豆杉和杂种红豆杉。1990年 NCI 主持召开的紫杉醇研讨会上，将植物细胞培养生产紫杉醇作为 NCI 的投资重点之一。Larue 和 Tuleke 分别于 1953 年和 1959年对红豆杉配子体及花粉进行了体外培养研究。自1970 年以来，Le Page-Degivry 先后发表了一系列有关红豆杉胚萌发的研究报道，首篇有关愈伤组织增殖的报道发表于 1973年，Amos 及 Barnes 分别于 1981 年及 1983 年报告了红豆杉的微繁殖研究结果。1989年，Christen 等首次报道了通过红豆杉细胞培养方法生产紫杉醇的研究情况。1991 年以来，有关红豆杉组织及细胞培养研究的文献报道
14、逐年增加。第 1 个有关通过组织培养生产紫杉醇的专利于 1991 年由美国的 Phyton Catalytic 公司申请并被批准。红豆杉种子具有休眠现象，在自然条件下几乎不萌发。如何打破种子休眠，使种子成苗，是一个至今仍未圆满解决的问题。1991 年，Flores 利用短叶红豆杉和杂种红豆杉的未成熟胚作为研究萌发的材料，使早期萌发的胚中大约有 30%形成完整实生苗，类似的结果在其他红豆杉上也有报道。Chee 等在 1995 年报道了短叶红豆杉的胚离体培养，成熟胚在附加 10mol/L6-BA 的 1/2B5改良培养基上培养，14d 后形成不定从芽，芽长成的嫩枝用生根粉处理，生根率约为 58%，
15、且形成的小植株能健康生长。因此，利用红豆杉胚培养在短时间内可获得一定数量的小苗，并有望从中选择出紫杉醇含量高的个体。虽然目前利用胚培养还不可能进行红豆杉的大量、快速繁殖，但利用胚培养所获得的优良个体作为育种和组织培养的起始材料仍有一定的意义。另外，红豆杉的茎尖、腋芽也可以诱导植株再生。扦插繁殖是人工种植红豆杉的基本手段，但该法没有经过选优，导致大量栽种的红豆杉中紫杉醇含量普遍偏低，再加上扦插过程中伤口被病菌感染，有的已出现退化现象。红豆杉及其次生代谢产物紫杉醇的研究也具有重大的社会价值和经济效益。紫杉醇的市场缺口相当大，单纯靠从数量稀少的天然植物中提取远远不能满足日益增长的需求。紫杉醇的化学合
16、成虽己获得成功，但由于紫杉醇结构复杂，不能进行大规模工业化生产。最具启发性的研究进展莫过于发现内生真菌中含有紫杉醇，通过进一步研究提高其含量，此法可能成为获取紫杉醇的重要途径。植物组织及细胞培养生产紫杉醇产量己达毫克级水平，并可获得紫杉醇半合成原料，若能进入商业化生产则可成为获取紫杉醇的另一重要途径。该项目通过对云南红豆杉品种选优，再通过无性繁殖组织培养的方式保持优良母本植株的性状，最后通过快繁技术将良种植株扩增栽种，不但能保证提取的原料含有较高的紫杉醇、10-DABIIl和巴卡亭IIl，而且对于红豆杉的资源保护来说也意义重大。 二、云南红豆杉的优势及分析（一）含量分析：红豆杉属植物在我国有4
17、种1变种，即中国红豆杉，云南红豆杉，东北红豆杉，西藏红豆杉（又称喜马拉雅红豆杉)和南方红豆杉又叫美丽红豆杉。各种中紫杉醇含量不一至：王达明从41个云南红豆杉天然林木样品中检测了其中紫杉醇、10-DAB和B的含量（树皮和小枝叶），其中树皮含量高达0.0304%,小枝叶中含量为0.0213%，最高的10-DAB含量为0.0696%,B的最高含量为0.103%，根系中出现紫杉醇含量为0.0421% -0.046%和B含量为0.103%的高含样品，均已达到世界著名紫杉醇原料树种曼地亚（杂种）红豆杉和欧洲红豆杉中紫杉醇和巴卡亭的高含量水平。；西藏红豆杉经云南省分析测试研究所检测，其紫杉醇最高含量可达0.
18、0225%，枝叶中含量为0.0083%；南方红豆杉含量相对偏低，枝条最高含量为0.0128%,树皮最高含量为0.01777%；中国红豆杉中紫杉醇最高含量为0.0089%,10-DAB在树皮中的含量仅为紫杉醇含量的1.7%,枝叶中的含量可达002 003%，B 的含量一般低于10一DAB；东北红豆杉的树皮中紫杉醇含量可达0.046%,枝叶中的含量可达0.0149%，10-DAB含量为0.4233%。而云南省林业科学院送昆明植物研究所检测的云南红豆杉样品中，10-DAB含量高达0.2059%,B含量为0.01%,紫杉醇含量也达到0.0133%。总的可供提取的这三种成分的含量相当高,紫杉醇含量在这几
19、种中也是较高的，再加上云南红豆杉在云南生长快，三年后即可采收小枝叶进行加工生产，云南红豆杉具有其他种红豆杉无可比拟的优势。（二）良种筛选概述：生产上，主要以就近或就地采集插穗的方式进行人工红豆杉的种植，紫杉醇、10-DAB和B含量的高低已成为原料基地建设关注的焦点。云南红豆杉选优方面的研究较少，主要是由于云南地势复杂、红豆杉分布广而稀疏、检测费用高昂等限制。筛选高含量紫杉醇、10-DAB和B云南红豆杉种源是培育优质、高产紫杉醇原料林的基础。关于云南红豆杉紫杉醇含量的说法不一，差异较大，相关研究较较少，至今尚无系统取样分析资料出现，而10-DAB和B的相关研究就更少了。苏建荣从云南十二个地州采取
20、云南红豆杉样品检测，结果表明，景东种源树皮含量为0.0331%,兰坪种源3年生小枝紫杉醇含量为0.0076%，从藏东南六个县取样检测的结果来看，这三种成分的含量并不高，紫杉醇在树皮、三年生小枝中的含量分别为：0.0109%和0.0104%,10-DAB和B的含量为：0.0584%和0.0364%。王达明从30个天然林木树皮中测得紫杉醇含量高达0.03%,枝叶中10-DAB和B合计可达0.08%,与欧州红豆杉中的含量相当，并认为从遗传因素及生态环境等因素进行研究和改进，有望提高云南红豆杉药用成分的含量。（三）遗传多样性高云南红豆杉天然群体的遗传多样性水平比较高，主要是因为云南红豆杉寿命长，世代重
21、叠，由于选择压的作用，林分中各林级在建立时保留下各自适宜的基因，因此积累较多的基因，形成较广的遗传基础。（四）净化作用云南红豆杉能释放各种有益的生物碱气体气体，对大气污染物如SO2、NO2有一定抗性和净化能力，其对SO2的净化能力较弱，对NO2的抗性较强，它的大面积种植，可降解大气污染物对种植区周边环境起到明显净化作用，对人体来说也有疗养保健的作用。云南红豆杉树形优美，种子成熟时红色夺目，还可做人行道和公园绿化树种。云南红豆杉中紫杉醇、10-DAB和B含量极高，通过选优培育，建立人工原料林基地，不但可保护对天然红豆杉资源，为紫杉醇产业提供大量的原料供给，还可净化空气，减轻污染，从根本上解决目前
22、紫杉醇工业生产带来的各种隐患。三、本项目的先进性、创新性（一）本项目所用的材料均为经筛选的良种云南红豆杉，在很大程度上确保了母本的遗传优越性。目前，人工红豆杉栽种基本都采用直接从就近或就地采集插穗，采取的插穗并不全是同一母株上的，经诱导生根长成小苗后进行移栽。这种方法没有经过优良品种的筛选，各株差异较大，紫杉醇、10-DAB和B含量有高有低，其次根系不发达，造林成活率低。采用该项目从具有广泛遗传多样性的云南红豆杉中筛选优良植株，使用组织培养技术保持子代的遗传特性，利用快速繁殖技术进行红豆杉大面积栽种，不但可保证具有充足的紫杉醇工业化生产所需的原料来源，也避免造成天然红豆杉资源枯竭、物质丧失和物
23、种灭绝，对环境污染治理来说，也是不可多得的优良措施。（二）该项目的研究成果既有重要的理论价值又有潜在的应用价值。本项目从良种筛选出发，经组织培养、快速繁殖，一方面为红豆杉的快速繁殖提供了理论参考，另一方面还可以提供性状优良、数量充足的红豆杉的种苗，保证了红豆杉资源的供给。四、实施方案（一）技术特点及关键技术（1）收集各地云南红豆杉自然分布区内的各种种源，取样进行检测分析，云南红豆杉分布广，遗传多样性水平较高，可供选择的面大。（2）选择优良种源，建立优良种群的云南红豆杉采种母树林和初级种子园，进行选育优良的高紫杉醇含量的云南红豆杉栽培品种的实验研究。（3）建立规模化、优质化的云南红豆杉组织培养基
24、地，进行人工育苗，（4）开展快繁研究，为基地化、规模化、产业化种植提供组培苗木保证。（5）除消毒过程中使用极少量升汞外后，整个生产过程基本不使用有毒有害物质，使用过的升汞废液也集中处理。（二）实施的具体内容和技术路线实施内容：利用植物组织培养技术，以经良种选育的云南红豆杉茎叶为外植体，诱导愈伤组织，愈伤组织在进一步分化为小苗， 从23年生小苗上剪取枝叶，检测2-3年生幼苗中紫杉醇、10-DAB和BIIl，确认无变异且是高含量植株后，进行快速繁殖。其具体基本技术路线为：（1）良种云南红豆杉的筛选选取云南各地州采取云南红豆杉的茎、叶及树皮。样品阴干后进行紫杉醇、10-DAB和巴卡亭IIl的含量测定
25、，从选取的样品中选择最高含量的植株（或者是紫杉醇含量最高、或者是10-DAB含量最高或者是巴卡亭IIl含量最高，或者是二种以上物质含量都高的植株）作为组织培养材料。从选定的红豆杉植株上摘取茎、叶作为外植体备用。（2）外植体消毒处理植物组织培养的理论研究虽已相当深入，但它的技术环节还存在不少问题。其中，污染是首先而且经常遇到但又很难控制的问题，能否把污染率降低到可以接受的范围，也就成为组培工作能否进行下去的关键。因此，控制污染成了组织培养中的关键技术之一。本试验旨在通过单因素预试验，筛选和确定云南红豆杉愈伤组织诱导过程中影响消毒效果的主要因素，并通过正交试验优化消毒方案，为紫杉醇的规模化生产提供
26、基础资料。对植物选材、酒精浓度、升汞浓度、升汞浸泡时间等影响因素进行筛选并以愈伤组织诱导率、污染率、死亡率以及培养基颜色变化作为指标进行评定。其中，愈伤组织诱导率=愈伤组织数/外植体数；外植体表面或周围的培养基出现肉眼可见的菌落者即判定为污染；外植体大部分变成深褐色或黑色者即判定为死亡；外植体周围出现红色者记为+，整个培养基变红者记为+，无明显变化者记为-根据单因素预试验结果进行正交试验设计。对正交试验中愈伤组织诱导率、污染率和死亡率的结果进行直观分析，确定出南方红豆杉外植体的最佳消毒方案。（3）愈伤组织的诱导在确定了外植体的消毒方案基础上，以 MS 培养基为基本培养基进行愈伤组织的诱导，对萘
27、乙酸（NAA），6-苄胺基嘌呤（6-BA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）三种激素的浓度配比进行正交试验，通过测量各处理组的愈伤组织诱导率，筛选出最佳的诱导培养基激素配比。确定诱导愈伤组织的最佳培养基。另外，在愈伤组织的继代培养阶段，也要对NAA、6-BA、2，4-D三种激素的配比进行优化。（4）褐变抑制剂的筛选红豆杉愈伤组织的褐变与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激素配比等因素有关。因此，要防止褐变发生，减轻褐变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激素组合外，添加抗褐变剂是较为方便有效的常规手段。目前常用的抗褐变剂有 EDTA、植酸（PA）、水解酪蛋白、硫代硫酸钠、活性炭（A
28、C）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗坏血酸（Vc）等。以往的研究中一般是单独使用某一种抗褐变剂，而在所有进行过组培研究的植物当中，红豆杉愈伤组织的褐变问题是较为严重，故而效果都不是很好。红豆杉愈伤组织的褐变主要是在多酚氧化酶（PPO）的催化下发生的，PPO 是一种含铜离子的酶，上述抗褐变剂中 PA 能够络合铜离子，水解酪蛋白可以与酶底物竞争性结合，而 AC 可以对酶进行吸附，因此考虑此三者可能存在协同抗褐变作用，故本项目将其联合应用，以筛选抗褐变较好的抑制剂。（5）生根培养基的优化云南红豆杉愈伤组织细胞不断的分化形成胚芽，以MS培养基为基本培养基进行生根培养基的优化，促进小苗的生长。对NAA的浓度进行实验，确定其最佳浓度。（6）组培苗的种植与紫杉醇、10-DABIIl和巴卡亭IIl的检测分化的云南红豆杉小苗，经驯化后可户外种植。并检测2-3年生幼苗中紫杉醇、10-DAB和巴卡亭IIl。 （7）快速繁殖及移栽 经检测确认无变异且是高含量植株后，进行快速繁殖、幼苗培育及移栽。
