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1、实验报告班级：制药092 学科：药物合成技术 实验名称： 青霉素发酵实验目的：1、了解（半合成）青霉素合成的生产工艺原理及过程 2、了解微生物发酵技术生产药物的常用技术 3、掌握微生物发酵在半合成青霉素生产中的应用 4、掌握利用离子交换树脂分离药物的方法实验仪器：发酵罐、进料泵、空气系统、计量泵一（加氨水）、计量泵二（加前体）、计量泵三（加消沫剂）、加菌种按钮、预处理罐、转筒真空过滤 器、混合罐、分离机、脱色罐、活性炭进料按钮、结晶罐、真空抽滤机、洗涤罐、移出晶体按钮、真空干燥机、输入时间系统实验内容：一、实验原理及相关知识1、青霉素的分子结构：青霉素是6氨基青霉烷酸（6-aminopenic
2、illanicacid,-APA）苯乙酰衍生物。侧链 基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它们的差别仅在于侧链R基团的结构不同，其中青霉素G在医疗中用得最多，它的钠或钾盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强大的抑制作用。2、青霉素的作用机理：青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。细菌的细胞壁主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的5080（革兰
3、氏阴性菌为110）、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。青霉素作用的部位就是这个转肽酶。现已证明青霉素内酞胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基-酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。通过抑制转肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。 3、 发酵：这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。接种量一般为520%。发酵周期一般为
4、45天，但也有少于24小时，或长达二周以上的。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。4、发酵培养基的介绍：培养基是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。青霉素的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部分组成。5、提取：青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH
5、，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择2.8-3.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.2。为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.83.0，加入醋酸丁酯。在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。二 、实验步骤：（操作规程） A发酵工艺过程(1)、正常发酵过程： 1、 进料(基质)，开备料泵 2、 开备料阀 3、 备料后（罐重100
6、000KG）关备料阀 4、 关备料泵 5、 开搅拌器 6、 设置搅拌转速为200转 7、 开通风阀 8、 开排气阀 9、 投加菌种 10、补糖，开补糖阀 11、补氮，开加硫铵阀 12、开冷却水，维持温度在25 13、PH值保持在一定范围内 14、前体超过1KG/M3（扣分步骤，出现则扣分） (2)、出料1、 停止进空气 2、 停搅拌 3、 关闭所有进料，开阀出料 (3)、发酵过程中PH值低调节PH值开大氨水流量 (4)、发酵过程中PH值高关闭进氨水 开大补糖阀 调节PH值 （5）、发酵过程中溶解氧低开大进空气阀V02 调节溶解氧大于30%(6)、残糖浓度低开加糖阀补糖 (7)、发酵过程中温度高
7、开通冷却水进水冷却 温度指标 (8)、泡沫高 添加消泡剂 泡沫高度降低到30CM B 提炼工艺过程(1)、预处理操作 1、打开阀V14，加发酵液。2、待加料至5000kg时，关闭阀V14。3、打开预处理罐搅拌器4、打开阀V13，加黄血盐，去除铁离子。5、观察铁离子浓度变化，待铁离子浓度为零时，关闭阀V13。6、打开阀V12，加磷酸盐，去除镁离子。7、观察镁离子浓度变化，镁离子浓度为零时，关闭阀V12。8、打开阀V11，加絮凝剂，去除蛋白质。9、观察蛋白质浓度变化，蛋白质浓度为零时，关闭阀V11。10、打开阀V16、V17及泵P5，同时打开转筒过滤器开关及后阀V18。11、待发酵液经过滤排至混合
8、罐B101后，关闭阀V16、V17、泵P5以及转筒过滤器开关及后阀V18。12、 停止预处理罐搅拌器。(2)、一次BA萃取操作1、打开混合罐B101搅拌器2、打开阀V19，加BA（醋酸丁酯）质量为发酵液的1/41/3倍。3、关闭阀V19。4、打开阀V22，加稀硫酸调节PH值。5、待PH值调节至23时，关闭阀V22。6、打开阀V21，加破乳剂。7、加破乳剂量为100kg时，关闭阀V21。8、打开阀V23、V24及泵P6，向分离机注液。9、待分离机中有液位时，迅速打开A101开关。10、打开萃余相回收阀V26，调节V26阀门开度，控制重相液位在总液位的80%左右，使轻相液能充分的溢流至B102。1
9、1、 待混合罐B101液体排空后，关闭阀V23、V24及泵P6。12、 停止混合罐B101搅拌器。13、 待分离机A101中液体排尽后，关闭阀V26。14、 关闭分离机A101开关（3）、一次反萃取操作1、打开混合罐B102搅拌器。1、 打开V28，加碳酸氢钠溶液，质量为青霉素溶液的34倍，并调节PH值为782、 待PH值调节至78时，关闭阀V28。3、 打开阀V29、V30及泵P7，向分离机A102注液。4、 待分离机A102中有液位时，迅速打开A102开关。5、 打开萃余相回收阀V32，调节V32阀门开度，控制重相液位在总液位的80%左右，轻相液能充分的溢流出。6、 待混合罐B102液体排
10、空后，关闭阀V29、V30及泵P7。7、 停止混合罐B102搅拌器。8、 待分离机中剩余少许重液时，关闭阀V32，防止轻液流入混合罐B103中9、 关闭分离机A102开关(4)、二次BA萃取操作1、打开混合罐B103搅拌器。2、打开阀V33，加BA（醋酸丁酯）质量为发酵液的1/41/3倍。3、关闭阀V33。4、打开阀V35，加稀硫酸调节PH值。5、待PH值调节至23时，关闭阀V35。6、打开阀V36、V37及泵P8。7、待分离机中有液位时，迅速打开A103开关。8、 打开萃余相回收阀V39，调节V39阀门开度，控制重相液位在总液位的80%左右，使轻相液能充分的溢流至脱色罐中。10、 待混合罐B
11、103液体排空后，关闭阀V36、V37及泵P8。11、 停止混合罐B103搅拌器。12、 待分离机A103中液体排尽后，关闭阀V39。13、 关闭分离机A103开关。(5)、脱色罐操作1、 打开活性炭进料阀。2、 选择进料量，进料25kg3、 进料4、 关闭进料阀。5、 打开脱色罐搅拌器，并设定搅拌时间：10min6、 搅拌10min后，打开阀V41、V42及泵P9，将青霉素溶液经过过滤器排至结晶罐。7、 待脱色罐液体排空后，关闭阀V41、V42及泵P9。8、 停止脱色罐搅拌器。（6）、结晶罐及抽滤、干燥操作1、 启动结晶罐搅拌器2、 打开阀V43，向结晶罐中加入醋酸钠-乙醇溶液。3、 观察青
12、霉素浓度，待青霉素刚好反应完时，关闭阀V43。4、 打开冷却水阀V44及VD10，控制结晶罐温度为5以下，并输入保持时间，保持10min。5、 打开阀V45、V46及泵P10，将结晶液排至真空抽滤机进行抽滤6、 待真空抽滤机中上层液位达到50%左右后，迅速打开真空阀V47，进行抽滤。7、 同时打开V48，回收母液。8、 待结晶罐中液体排空后，关闭阀V45、V46及泵P10。9、 停止结晶罐搅拌器10、 抽滤完成后，关闭真空阀V47。11、 待母液全部回收后，关闭阀V48。12、 点击“移出晶体”按钮，将抽滤后的晶体移入洗涤罐。13、 打开阀V49，加丁醇进行洗涤。14、 待丁醇加入量为500k
13、g时，关闭阀V49。15、 启动洗涤罐搅拌器，并设定时间为8min。16、 停止洗涤罐搅拌器。并设定时间，保持10min。17、 打开阀V50，排出废洗液。18、 待废洗液排尽后，关闭阀V50。19、 点击“移出晶体”，将洗涤后的晶体移至真空干燥机。20、 启动干燥机，进行干燥，并设定时间为20min21、 关闭干燥机开关，停止干燥。三、实验操作图发酵工艺操作界面发酵罐操作界四、实验过程 1发酵工艺过程：菌种的保藏孢子的制备种子制备发酵培养基培养灭菌发酵 2提炼工艺过程：发酵液预处理 提取 精制 脱色和去热原质 结晶 成品鉴定 成品分装 五、注意事项 1、防止染菌：染菌是抗生素发酵的大敌，不制
14、服染菌就不能实现质高产。影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。 2、空气系统的要求：防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤着手。防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。 3蒸汽系统的要求 ：重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在3035千帕以上。
15、 (1)、连续灭菌设备：连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。 (2)、发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。 (3)、无菌室：用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。六：主要工艺指标编号指标推荐值发酵罐1糖浓度5kg/m32氨氮含量0.250.3kg/m33PH值68-724温度255搅拌转速150-250rpm6溶氧浓度30%7前体浓度1kg/m38发酵液中硫氨浓度0.25kg/m39发酵罐压力0.07MPa一次BA萃取1醋酸丁酯（BA）用量青霉素溶液的1/32PH
16、值2.8-3.03破乳剂用量100kg4、重相液位80%一次反萃取1碳酸氢钠用量青霉素溶液的2.52PH值6.8-7.23重相液位80%二次BA萃取1醋酸丁酯（BA）用量青霉素溶液的1/32PH值2.8-3.03重相液位80%脱色罐1活性炭用量25kg结晶罐1结晶温度52丁醇用量500kg3青霉素钠盐晶体效价1670u/ml七、青霉素的应用及总结 临床应用：40多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。优点：毒性小，但由于难以分离除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起过敏反应），需要皮试。各种半合成抗生素的原料：青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对阴性菌无效。氨苄青霉素耐酸广谱；对抗绿脓杆菌的磺苄青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供头孢菌素母核。1083592864991593142
