植物细胞工程 课件.ppt

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1、第四章 植物细胞工程 Plant Cell Engineering,第一节 概述掌握植物细胞工程基本概念 及其主要内容 应用了解植物细胞工程的研究简史、现状 及发展前景 热点,植物细胞工程的发展历史,德国植物学家 Haberlandt,植物细胞培养创始人1902年根据细胞学说（cell theory）提出植物体细胞有再生完整植株的潜在全能性-细胞全能性（totipotency）,植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础,1904年，德国植物胚胎学家Hanning 用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株，首次获得胚培养成功。成熟 发芽 常规：幼胚 种子 植物 培养 组织培养：幼胚 植株,1

2、922年，Knudson 对兰花幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。1925年，Laibach 进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。1934年，White 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1934年，Gautheret 培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。,1937年，White 和Went 等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（IAA）对培养的离体根生长具有重要作用。1937-1938年，Gautheret 在1934年培养山毛柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入IAA 和B族维生素等，使形成层的生长大为增加。

3、,1937-1938年，Nobecourt 培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。,White、Gautheret、Nobecourt 等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础。,一.植物细胞工程基本概念：,原理和方法：细胞学、生理学、分子生物学及工程学原理对象：植物细胞设计改造：植物细胞遗传性

4、目标：创造新物种，提供名贵药品及服务,二.植物细胞工程研究主要内容：,植物细胞和组织培养技术 原生质体培养和融合技术植物的快速繁殖和人工种子植物染色体工程转基因技术,植物细胞工程 热点,1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。,第二节 植物细胞培养特性 及主要培养技术,细胞的全能性:一个细胞具有产生完整生物个体的固有能力。,一、重要概念,植物干细胞：植物胚性细胞（embryogenic cells

5、）即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）,一、重要概念,细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化细胞要表现全能性，先要脱分化成分生细胞，后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。,一、重要概念,外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，既是组织，又是脱分化细胞次生代谢产物：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。,一、重要概念

6、,一、重要概念,植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或长成完整的植株，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。,延迟期：细胞数恒定，高RNA含量，高蛋白质合成能力；加速期：细胞快速生长期。细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少；对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期

7、之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退；稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及高浓度有机化合物。,二、培养植物细胞 四个生长时期,（1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，次生代谢产物积累在稳定期（2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。（3）植物细胞好气，培养过程需供气及搅拌，（4）植物细胞较微生物细胞大得多，纤维素细胞壁，细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁,三、植物细胞的培养特点,（5）具有群体效应、无锚定依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且

8、产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。经过增殖与分化，能发育成为植株,三、植物细胞的培养特点,（1）必需元素大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（2）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（3）碳源，蔗糖（4）需多种维生素烟酸，B1，B6和植物生长激素 生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。（5）需有机物：甘氨酸或水解络酪蛋白，酵母提取液等。,四、植物细胞营养要求,A B,A：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）,A：NAA 0mg/L，芽（少），根（无）B：NAA

9、 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量,A B C,常用培养基MS、N6、B6、RM-1964、KM-8p等。MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。,五、植物细胞培养基,贮备液（母液）的配制 为什么要配制母液？1）、方便 2）、准确（有些成分量太小）以MS培养基配制为例：,1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。倒入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，

10、每配1L培养基取此液100ml。,注意：(1)某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl22H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl22H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。,、微量元素母液的配制MS

11、培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量10ml，微量ml,3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。,在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会

12、造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20-30 min)，调pH值至5.5，室温放置冷却后，再冷藏。,4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。,5、植物生长调节剂母液配制一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg

13、/ml为好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。（）细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl溶解，再用蒸馏水定容。（）GA3以95%酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）保存在棕色试剂瓶中。,注意：所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。,White的无机盐含量较低，适于生根培养。KM-8p主要用于原生质

14、体培养，含几乎所有单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。凡花药培养中常用培养基，成分较简单，且KN03和(NH)2N04含高。,五、植物细胞培养基,培养基的配制 1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）1000ml/母液浓度（mg/L）。2、移液取烧杯一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于烧杯中备用。,3、称取琼脂蔗糖备用4、融化用量杯量取600700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使

15、溶液外溢，造成烫伤。,5、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右)。,7、分装溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1L培养基，可分装2030瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加

16、一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9、培养基的灭菌,（一）植物细胞的获得1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎2.愈伤组织分离法：制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生。,六、植物细胞的培养技术,1.单细胞的培养（1）看护培养法（nurse culture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使细胞分裂增殖。即愈伤组织看护单细胞适用于难于培养的植物种类,（二）植物细胞的培养方法,（2）微室培养法：单细胞悬液接种

17、到人工制造一个小室（如凹玻片与盖玻片组成的微室），内含少量培养基，密封培养，使其分裂增殖形成细胞团的方法 连续观察，通气性差,1.单细胞的培养,（3）平板培养法：将制备好的单细胞悬液，按一定的细胞密度，接种于固体培养基上，或与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法 每个平板上形成的细胞团数植板率（%）=-100%该平板上接种的细胞数,1.单细胞的培养,（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系条件培养基：培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。,1.单细胞的培养,指将植物单倍体细胞花药培养成单倍体植株或经过染色体加倍成纯二倍体植株。花药培

18、养的基本程序是：外植体(花蕾)选择预处理花蕾消毒取花药接种诱导培养分化培养,2.单倍体细胞的培养（花药培养）,3.愈伤组织培养,愈伤组织，为脱分化细胞，具再分化的能力，可培养用于次生代谢物的生产，或再生为植株。,(cellsuspensionculture)游离植物细胞悬浮于液体培养基中振荡培养，细胞总数不断增加，产量达最高点后生长趋于停止，然后进行移植继代培养 方法,（4）细胞悬浮培养法,单细胞悬浮0.251050.5105细胞/ml,干燥保存法、液体石蜡覆盖法、低温保存法低压低氧保存法超低温深冻保存法,七、种质保存,超低温深冻保存法 材料：愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体

19、细胞胚状体、茎尖分生组织、小植株及茎芽-196液氮冰冻保护剂 二甲亚砜（DMSO）、甘油、山梨糖及蔗糖等，复合成分较单一成分效果佳，5%DMSO+1mol/L山梨醇存活率提高10倍左右。,七、种质保存,第三节原生质体培养 和融合技术,指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的且具有生活力的裸露细胞。,一、原生质体的概念,二、原生质体培养技术,用酶除去植物体细胞的细胞壁，获得原生质体。原生质体在良好的培养基上生长分裂，细胞壁再生，形成愈伤组织，诱导愈伤组织分化，长出茎、叶，根而形成植株。,（一）材料准备,无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞,（二）原生质体的制备,1，酶处理纤维素酶类半纤维素酶果胶酶类

20、酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。,2，原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。Percoll一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。,（二）原生质体的制备,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），荧光素不能自由通过质膜。伊凡蓝法：质膜受到严重损坏使细胞被染色,（三）原生质体活力检测,1.液体浅层培养2.固体培养3.液固 双层培养4.琼

21、脂糖珠培养,（四）原生质体培养方法,等渗培养基,或体细胞种子 概念 任何一种离体繁殖体包埋在含有营养成分和保护功能的物质中,在适宜条件下发芽出苗，发育成完整的植株，均可称之为人工种子。第一类是裸露的或休眠的繁殖体，适当干燥的体细胞胚、休眠的微鳞茎和微块茎等 第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等 海藻酸钠作包埋 第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等,人工种子,细胞分裂与细胞壁再生 愈伤组织形成 愈伤组织分化 植株再生,（五）、愈伤组织形成和植株再生,1.提高变异频率，2.细胞工程技术进行遗传重组的材料，细胞融合和基因转移必需在原生质体上进行。,

22、（五）、原生质体培养 意义,1、直接筛选法 有新表型或感观上出现可测定的差异进行选择的方法 2、间接筛选法 用与突变表现型具有某种相关的特性为指标筛选 硝酸还原酶缺陷型细胞突变体，培养基加入氯酸盐，酶作用下产生次氯酸，3、绿岛法 在植株上使叶面细胞产生突变并创造选择压力，令抗性突变细胞正常生长形成绿色斑点，谓之“绿岛”，切下绿岛即是突变细胞，经分散和培养后即可分化为完整突变植株，,三、细胞突变体筛选技术,体细胞杂交一）类型 两大类：对称融合（asymmetric fusion）两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（symmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后

23、再进行融合。核失活 X射线，碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸质失活罗丹明（R6G，抑制线粒体氧化磷酸化。,四、原生质体融合技术,1材料准备2原生质体的制备3融合方法 PEG，电融合4杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定,二）.融合过程,3融合方法 PEG，电融合,二）.融合过程,按比例混合双亲原生质体滴加 PEG摇匀静置滴加高钙高pH液，摇匀静置滴加原生质体培养液洗涤数次离心得原生质体细胞团筛选再生杂合细胞。,1）杂种细胞的选择系统外观选择互补选择荧光标记选择,4.杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定,2）体细胞杂种的鉴定 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。生化鉴定

24、：同功酶鉴定。分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。,4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定,RFLP 基因型之间限制性片段长度的差异 RAPD 建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术,4 杂种细胞选择系统与杂种植株的鉴定,原生质体培养13天，细胞壁再生 再生细胞一旦分裂，继续生长1 形成细胞团，发育成 愈伤组织，诱导分化出芽及根再生为完整植株；2 形成胚状体，再产生植株；,5、细胞壁再生愈伤组织形成和植株再生,1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种4、细胞器的互作研究,三）、融合技术应用,第四节 植物细胞大规模培养技术,植物细

25、胞规模培养技术要点,（1）细胞系的建立和选择,有效成分分析,悬浮细胞系,单细胞培养与筛选,细胞增殖,（2）优良细胞系的增殖培养 所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。,（3）大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。,培养方式

26、的选择：间歇培养流加间歇培养 两级或多级间歇培养 连续培养单级连续培养 多级连续培养 回流式连续培养 固定化细胞培养,提高细胞次生代谢产物的途径,（1）明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。,（2）选择适宜的起始材料 首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起

27、始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。,（3）选择合适的培养基成分 一般来说，增加培养基的N，P、K的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。,（4）外因 温度 pH 营养状况 通气状况,（5）激发子的应用 植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢

28、活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。A、非生物激发子，如辐射、金属离子等B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。,（6）培养技术的选择 包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统。为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养 为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液-液系统：分

29、离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。,第五节 植物转基因技术,将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染将目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株.转基因植物（Transgene plant）利用植物遗传工程进行DNA重组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。,一 植物转基因技术,1 生产抗体、重组

30、疫苗和多肽类药物 药用业价值的物质，多数正确折叠，2 作为生物反应器系统大规模地生产各种蛋白质和多肽等药物，促红细胞生成素、表皮生长因子、生长激素、单克隆抗体、干扰素和疫苗用抗原蛋白。,转基因植物应用,基因的获得、载体系统、基因转化、基因的表达与分析、细胞和组织培养再生出植株。,二 植物转基因技术过程：,农杆菌转化法,基因转化-将外源基因导入细胞方法第一类：农杆菌转化技术，间接转化利用农杆菌的Ti质粒将外源基因转入植物细胞。转基因植物中约80%是此转化而来第二类：直接转化技术。基因枪法、电激法、原生质体转化法、碳化硅纤维介导法和花粉管通道法等。,三 基因导入技术,农杆菌在VirD2蛋白帮助下，

31、选择性将T-DNA（转移DNA）（插入Ti质粒上两个25bp重复序列之间）转移到植物染色体上。,四 农杆菌转化系统,三个功能区。转移DNA区（T-DNA区）。毒性区（Vir区）冠瘿碱代谢基因的编码区。,天然的野生型Ti质粒,（Vir区），,25bp的重复序列,构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒筛选标记基因 启动子 信号序列；人工多克隆位点；缩短载体长度。,对野生型Ti质粒的改造：,1原生质体受体系统 改变膜的通透性，烟草、番茄、水稻、小麦和玉米等250多种成功，2愈伤组织受体系统 外植体，愈伤组织，易接受外源DNA，遗传稳定性较差。3种质系统 生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞，是单倍体细胞

32、，成功率高,五受体系统,4胚状体再生系统 最理想体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，繁殖效率高，可通过生物反应器进行大规模生产。5直接分化芽受体系统 由未分化的细胞直接分化形成，稳定遗传。操作简单、周期短。转化频率最低,受体系统,1 基因水平的检测，限制性内切酶分析、DNA序列分析、聚合酶链式反应(PCR)、Southern blot分析、Northern blot分析、原位杂交,六 转入基因表达 分析,酶联免疫吸附法(ELISA)Western杂交-D-葡糖醛酸糖苷酶的组织化学定位分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的荧光分析、-D-葡糖醛酸糖苷酶的化学发光分析荧光素

33、酶分析。定量实时PCR(quantitative real-time PCR)术 通过荧光报告物对PCR反应对基因组中的某个单拷贝基因进行实时检测转基因的拷贝数。PCR产物量与起始模板量成正比。,2 表达分析的方法,Outline,植物细胞工程基本概念：定义内容植物细胞培养特性。,植物细胞一般培养技术,植物细胞营养需求培养方式培养条件植物细胞种质保藏。,植物细胞原生质体培养技术,原生质体制备培养方法及其再生原生质体培养意义。,植物原生质体融合技术,促融因素融合过程杂种细胞筛选技术。,植物细胞大规模培养技术,培养方式培养条件影响培养的因素。,植物转基因技术,了解植物基因转化的受体系统掌握植物细胞转化方式。,