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1、细胞凋亡实验细胞凋亡的检测 原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 : ? 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
2、 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder的特征。而细胞坏死时，DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”条带。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.025g/
3、ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1g/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时，也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合
4、碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。 再进一步用DNA Ladder 测定观察细胞凋亡情况。: 试剂 三尖杉酯碱，300g/ml， PI母液：500g/ml，Ho33342母液：2mmol/L。溶解缓冲液 (含5OmM Tris、lOmM EDTA、O.5%肌氨酸钠、0.25mg/ml蛋白酶K)5Oml， 取lM Tris-HCl PH8.0 2.5m1、 5OOmM EDTA PH8.01ml、10%肌氨酸钠(先水浴溶解)2.5ml、lmg/ml蛋白酶K l2.5ml、 SDW31.5ml。TBE电泳缓冲液:(含90mM Tris、90mM 硼酸、2mM E
5、DTA)l0O0ml，取1M Tris-HCl PH8.0 90ml、0.5M EDTA PH8.0 4m1、0.45M硼酸2OOml、SDW706m1。 仪器设备 荧光显微镜、载玻片、盖玻片、 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统。Yw7 R0 实验材料 人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37，5%CO2条件下培养。 方法 / w/ k: c* y$ 9 h 1. 三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每瓶含约6ml培养液，置37，5%CO2培养箱培养。 2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，号瓶加入三
6、尖杉酯碱200l，使终浓度为1g/ml，号瓶中加入同等量PBS作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。 2.Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 1）染色：将瓶中的细胞摇匀，取200l于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2l，PI 20l，染色15分钟。 2）滴片：取一载玻片，用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10l，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。 注意 1).诱导培养HL-60细胞时间要准确。 2.）荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。 3. DNA Ladder 测定 1）收集2106细胞(诱导凋亡细胞)离心沉淀，加0.5m1溶解缓冲液(视细胞量加减量)混匀，置50孵育1小时。 2）加RNaseA(O.l5mg/ml)于5O孵育1小时。 3）加10ul lOmM EDTA (含1%低熔点琼脂糖) 4）于70加热后，加入1.2%琼脂糖中，电压40V 电泳1.5小时(电泳缓冲液用TBE)。 5）电泳结束后于凝胶成像分析仪照相分析结果。
